鞣花酸通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB途径抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

目的基于Toll样受体4(TLR4)-酪氨酸激酶(SRC)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路探讨鞣花酸的抗炎机制。方法采用不同浓度(0、0.5、5、25、50、75、100μmol·L^(-1))鞣花酸对RAW264.7巨噬细胞[或脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞]干预24 h,噻唑蓝(MTT)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适给药浓度。实验分为空白对照组,模型组(0.5 mg·L^(-1)LPS),阳性对照地塞米松组(10μmol·L^(-1)),鞣花酸(5、25、50μmol·L^(-1))给药组。Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素-2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平;采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白以及TLR4-SRC/MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达水平。结果MTT结果筛选出鞣花酸的干预浓度为5~50μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,模型组PGE_(2)、NO和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.01);炎症标志物iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),说明炎症模型建立成功。与模型组比较,鞣花酸能显著抑制LPS诱导NO、PGE_(2)的产生和降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05,P<0.01),降低i NOS、COX-2蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;显著抑制TLR4蛋白的表达水平以及SRC、P38、JNK、p65、IκBα蛋白的磷酸化水平,并呈浓度依赖性。但对ERK1/2蛋白磷酸化没有显示出明显的抑制作用。结论鞣花酸可能通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB信号通路的调控抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,具体的调控机制有待进一步研究。

TRIB3靶向AKT磷酸化调控高糖条件下小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的机制研究

目的探讨TRIB3介导高糖条件下巨噬细胞促炎性M1型极化的下游机制。方法以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象:1)细胞分为对照(CON)组和高糖(HG)组,Western blot检测TRIB3、p-AKT和AKT蛋白;在各组内分为DMSO组和SC79组/MK2206组,使用AKT激动剂SC79或抑制剂MK2206处理细胞,Western blot检测p-AKT和AKT蛋白。2)细胞随机分为Control vector-DMSO组、TRIB3 overexpress-DMSO组、Control vector-SC79组、TRIB3 overexpress-SC79组、Control vector-MK2206组和TRIB3 overexpress-MK2206组,CCK8检测细胞活性,相差显微镜观察细胞形态并采集图像,Western blot检测TRIB3、pAKT、AKT、iNOS和Arg-1蛋白,ELISA检测细胞培养液中IL-1β和IL-10分泌。结果1)与CON组相比,HG组TRIB3显著增加、p-AKT/AKT显著下降。HG-SC79组p-AKT/AKT显著高于HG-DMSO组且与CON-SC79组无显著差异;HG-MK2206组pAKT/AKT显著低于HG-DMSO组。2)与对应的Control vector组相比,TRIB3 overexpress组TRIB3均显著增加、p-AKT/AKT均显著下降;与对应的DMSO组相比,SC79组p-AKT/AKT均显著增加、MK2206组p-AKT/AKT均显著下降。与Control vector-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-DMSO组出现较多长梭形和不规则形细胞,iNOS和IL-1β显著增加,IL-10显著减少。与TRIB3overexpress-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-SC79组长梭形和不规则形细胞明显减少,iNSO和IL-1β显著下降,IL-10显著增加;TRIB3 overexpress-MK2206组长梭形和不规则形细胞进一步增加,Arg-1和IL-10显著下降,IL-1β显著增加。结论高糖环境下巨噬细胞中激活的TRIB3蛋白通过靶向负调控AKT磷酸化水平发挥诱导巨噬细胞M1型极化、抑制M2型极化的促炎作用。

敲低双特异性磷酸酶5(DUSP5)通过阻断NF-κB信号抑制卡介苗诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的探讨双特异性磷酸酶5(DUSP5)对卡介苗(BCG)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应的调控作用。方法Western blot法检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞0.5、1、2、4、6、8、12、24 h,DUSP5表达变化;采用小干扰RNA(siRNA)技术下调RAW264.7巨噬细胞DUSP5水平,并设置siRNA阴性对照(si-NC)组、DUSP5敲低(si-DUSP5)组、si-NC联合BCG感染组、si-DUSP5联合BCG感染组。实时定量PCR检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量;Western blot法检测细胞核因子κB(NF-κB)与磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达变化。结果BCG感染上调RAW264.7巨噬细胞核DUSP5蛋白表达,并在BCG刺激4 h后,DUSP5表达量达到高峰;与si-NC联合BCG感染组相比,敲低DUSP5抑制细胞促炎因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达与分泌,而抑炎因子IL-10表达不受DUSP5的影响;且敲低DUSP5抑制细胞NF-κB磷酸化。结论敲低DUSP5通过阻断NF-κB信号抑制BCG介导的巨噬细胞炎性反应。

大粒车前子多糖对脂多糖刺激RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

采用脂多糖构建RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究大粒车前子多糖的抗炎作用。培养巨噬细胞RAW264.7,利用脂多糖构建细胞炎症模型,中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;酶联免疫吸附法检测车前子精制多糖(Plantago asiatica L.crude polysaccharide,PLCP)处理前后细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和IL-6的分泌量,Griess反应测定RAW264.7细胞释放NO水平。结果表明,PLCP可显著抑制RAW264.7炎症细胞的吞噬活性,降低炎症细胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌量及NO的释放量。

牡丹花蕊黄酮对H_2O_2诱导RAW264.7巨噬细胞损伤的保护作用

目的:研究牡丹花蕊黄酮对H_2O_2诱导损伤的RAW264.7巨噬细胞的保护作用。方法:实验分为空白组、H_2O_2损伤组、VC对照组和牡丹花蕊黄酮低、中、高剂量组。应用H_2O_2建立RAW264.7巨噬细胞氧化损伤模型,噻唑蓝法测定细胞存活率,试剂盒法测定细胞和细胞培养液中谷胱甘肽和丙二醛含量及过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶活力。结果:牡丹花蕊黄酮的质量浓度在10～30μg/mL范围内时,可显著促进RAW264.7巨噬细胞的增殖(P<0.05)。与H2O2损伤组相比,牡丹花蕊黄酮各剂量组能够提高细胞及细胞培养液中总抗氧化能力,谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物酶、过氧化氢酶活力以及还原型谷胱甘肽含量,降低细胞及细胞培养液中丙二醛含量,提高细胞内乳酸脱氢酶的水平。结论:牡丹花蕊黄酮可以促进RAW264.7巨噬细胞的增殖,提高H_2O_2损伤的RAW264.7巨噬细胞的抗氧化能力,且存在剂量依赖效应。

木犀草素对活化的RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的炎症是机体的一种防御性反应,但过度的炎症又会导致机体损伤。文中旨在探讨木犀草素对LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响及机制。方法将细胞分为对照组、LPS+IFN-γ组、木犀草素低、中、高剂量组。对照组:不加药的RAW264.7细胞;LPS+IFN-γ组:终浓度为10 ng/m L LPS+20 ng/m L IFN-γ刺激细胞M1极化;木犀草素低剂量组:LPS+IFN-γ与终浓度为5μmol/L的木犀草素同时刺激;木犀草素中剂量组:LPS+IFN-γ与10μmol/L的木犀草素共同刺激;木犀草素高剂量组:LPS+IFN-γ与20μmol/L的木犀草素共同刺激。激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化;Real time-q PCR检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、IL-1β和IL-6基因的表达,ELISA检测上清TNF-α和IL-6的分泌,Western blot检测蛋白通路phospho-STAT3(ser727)(p-STAT3)的变化。结果活化的RAW264.7细胞形态发生明显变化,与对照组比较,其余4组i NOS、IL-1β、IL-6均降低(P<0.05);与LPS+IFN-γ组i NOS(98.91±10.65)比较,木犀草素高剂量组(29.52±3.07)明显降低(P<0.01);与LPS+IFN-γ组IL-1β(110.69±4.12)比较,木犀草素中剂量组、木犀草素高剂量组(78.38±8.65、41.59±6.80)明显降低(P<0.05),与LPS+IFN-γ组IL-6(394.10±33.47)比较,木犀草素低、中、高剂量组(177.51±19.28、106.14±5.63、27.15±1.26)明显降低(P<0.05)。LPS+IFN-γ能诱导RAW264.7细胞M1表型的p-STAT3(ser727)上调,与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组p-STAT3明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组M1源性的p-STAT3-ser表达下调(P<0.05),并呈剂量依赖性。与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组IL-6、TNF-α表达明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组IL-6、TNF-α表达明显下调(P<0.05)。其中IL-6呈浓度依赖性,TNF-α不呈浓度依赖性。结论木犀草素可能通过下调p-STAT3抑制RAW264.7细胞致炎因子的表达,从而发挥抗炎作用。

槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p38、iNOS表达的影响

目的探讨槐定碱(sophoridine,SRI)在内毒素导致的炎症反应中的作用。方法采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型,实验细胞分为5组(n=6):空白对照组、LPS组、槐定碱组、SB203580组、SB203580+槐定碱组,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测RAW264.7巨噬细胞p38 mRNA表达量;利用Western blot技术检测RAW264.7巨噬细胞p-p38与iNOS蛋白的表达量。结果槐定碱组与LPS组比较p-p38蛋白表达量和p38 mRNA表达量降低,但高于空白对照组(P<0.01),表明槐定碱可以抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p-p38蛋白表达和p38 mRNA表达量;与LPS组比较,槐定碱组iNOS蛋白表达量降低,但高于空白对照组(P<0.01),SB203580+槐定碱组iNOS蛋白表达量低于槐定碱组和SB203580组(P<0.01),表明槐定碱可以抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞P38MAPK信号通路下游iNOS蛋白表达,并且与SB203580有协同作用。结论槐定碱可以通过抑制p38MAPK位点而下调p-p38、iNOS蛋白表达而发挥抗炎作用。

槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14、P38、iNOS表达的影响

目的探讨槐定碱不同给药方式对内毒素诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞表达CD14、p38 MAPK及i NOS的影响及意义。方法采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型;实验细胞分为4组(n=6):空白对照组、LPS组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组;分别利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p38、i NOS m RNA表达量及蛋白表达量。结果槐定碱2种给药方式(预处理及预混合)均可显著下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p38、i NOS m RNA及CD14、p-p38、i NOS蛋白表达;槐定碱与LPS预混合可下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14 m RNA表达,而槐定碱预处理对CD14 m RNA表达无明显影响。结论槐定碱可能通过调控CD14、p38、i NOS表达与活化发挥抗内毒素效应。

ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

目的探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体,通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况,酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量;用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化,分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响;检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的相对表达情况,分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰;在时相上,除琥珀酰修饰外,随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势,其中以6 h乳酰化修饰最多;ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响;经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上,IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6~8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式,改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

HSF1抑制热应激所致RAW264.7巨噬细胞凋亡

目的:探讨热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)对热应激所致Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡的影响。方法:采用热应激(4 2.5℃±0.5℃)处理稳定表达小鼠HSF1基因的Raw2 6 4.7巨噬细胞1h,3 7℃分别恢复6,9,1 2,2 4 h,采用流式细胞术,hoechst3 3 2 5 8染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:流式细胞术结果显示,热应激后对照组(转空载体)细胞凋亡核百分率较热应激前明显升高,9 h达峰值(约为6 0%),此时荧光染色可见3 0%的细胞出现核固缩,凋亡小体等典型的凋亡形态学改变;并于热应激后6,9,1 2 h均能检测到清晰的DNA梯状条带。与转空载体对照组相比,HSF1过表达能显著降低热应激所致凋亡及明显抑制DNA的断裂。结论:HSF1可以抑制热应激所致的Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡。

二甲双胍激活AMPK通路减轻饱和脂肪酸诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的观察二甲双胍对饱和脂肪酸(SFA)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应中炎性因子的影响及探讨其可能机制。方法 SFA干预RAW264.7巨噬细胞建立体外炎性反应模型;实验分为对照组、SFA干预组、二甲双胍+SFA干预组、AMPK抑制剂Compound C+二甲双胍+SFA干预组;实时定量PCR检测TNF-α和IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测TNF-α和IL-6蛋白的分泌,Western blot分析腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平。结果与对照组比较,SFA干预组RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6 mRNA表达及蛋白分泌水平均显著升高(P<0.05);与SFA组比较,二甲双胍+SFA干预组TNF-α、IL-6 mRNA表达水平及蛋白分泌水平均降低(P<0.05),而细胞AMPK的磷酸化水平增强(P<0.05);与二甲双胍+SFA干预组比,Compound C+二甲双胍+SFA干预组TNF-α、IL-6 mRNA表达及蛋白分泌水平均升高,AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)。结论二甲双胍激活AMPK降低饱和脂肪酸诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-6的分泌。

槐定碱预处理对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞c-Jun表达的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞c-Jun表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞,以槐定碱(31.25mg.L-1)预处理细胞24h后给予LPS(E.coli O55:B5)100μg.L-1刺激细胞,并于刺激后5、30、60、120min收集细胞;再以槐定碱31.25、15.63、7.81mg.L-1三个浓度同上预处理细胞,于LPS刺激后60min收集细胞。利用免疫细胞化学技术检测RAW264.7巨噬细胞中c-Jun的表达。结果单独槐定碱对c-Jun表达无影响;LPS模型组各时间点c-Jun阳性细胞数均显著高于巨噬细胞对照组(P<0.01),且随LPS刺激时间延长而升高,持续升至120min;槐定碱预处理组在LPS作用后30、60、120min时c-Jun阳性细胞数均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义(均P<0.01),但槐定碱预处理组各时间点c-Jun阳性细胞数无明显变化。不同浓度槐定碱(31.25、15.63、7.81 mg.L-1)预处理细胞,对LPS刺激的c-Jun表达均有显著抑制作用(均P<0.01),且31.25 mg.L-1的作用强于另两个浓度(15.63、7.81mg.L-1),差异有统计学意义(均P<0.05)。结论槐定碱预处理RAW264.7巨噬细胞能显著抑制LPS诱导的c-Jun蛋白表达,其作用有剂量依赖性。

IL-18和TNF-α增加3T3-L1脂肪细胞及RAW264.7巨噬细胞IL-18Rβ的水平

目的探讨白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)对3T3-L1脂肪细胞、RAW264.7巨噬细胞的白细胞介素18受体β(IL-18Rβ)表达的影响。方法采用反转录PCR和Western blot法检测不同浓度IL-18、TNF-α处理后3T3-L1脂肪细胞、RAW264.7巨噬细胞的IL-18RβmRNA及蛋白的表达。结果 10 ng/m L、100 ng/m L TNF-α显著增加3T3-L1脂肪细胞IL-18Rβ的mRNA及蛋白表达,10 ng/m L、100 ng/m L IL-18显著增加RAW264.7巨噬细胞IL-18Rβ的mRNA及蛋白表达。结论IL-18、TNF-α可能通过促进巨噬细胞、脂肪细胞IL-18R的表达参与糖尿病和肥胖的脂肪组织慢性炎症过程。

桂皮醛对LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞迁移和M1极化的抑制作用研究

目的研究桂皮醛对脂多糖(LPS)诱导的Raw264.7巨噬细胞迁移和M1极化的抑制作用。方法培养Raw264.7巨噬细胞,随机分为空白对照组(不加LPS及药物)、LPS组(加入终浓度为20μg·L^(-1)的LPS)、桂皮醛(0.1μmol·L^(-1),0.3μmol·L^(-1))组。应用Transwell小室法观察桂皮醛对LPS诱导的巨噬细胞迁移的影响;应用流式细胞术观察桂皮醛对LPS诱导的巨噬细胞M1极化的影响。结果 Transwell小室迁移实验结果与流式细胞术检测结果均显示,LPS(20 ug·L^(-1))可明显促进RAW264.7巨噬细胞的迁移及M1极化(P<0.01);与LPS组比较,桂皮醛0.1μmol·L^(-1)组、桂皮醛0.3μmol·L^(-1)组可明显抑制LPS诱导的Raw64.7巨噬细胞的迁移和M1极化(P<0.01),且桂皮醛0.3μmol·L^(-1)组作用优于桂皮醛0.1μmol·L^(-1)组(P<0.05)。结论桂皮醛对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的迁移和M1极化有明显抑制作用,且呈浓度依赖性。

5-氨基酮戊酸光动力疗法对小鼠RAW264.7巨噬细胞株吞噬活性和活性氧自由基的影响

目的探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinicacid photodynamic therapy,5-ALA-PDT)对RAW264.7细胞吞噬活性和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的影响。方法细胞实验研究用灭活痤疮丙酸杆菌诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,产生炎症细胞模型,给予不同浓度的5-ALA孵育RAW264.7细胞,并给予16 J/cm^2红光照射。采用中性红法检测巨噬细胞的吞噬活性,荧光显微镜观察细胞内活性氧离子的荧光强度,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法(dihydrochloride acetyl acid dichloride,DCFH-DA)检测活性氧自由基水平。结果模型组吞噬活性比空白组高,随着5-ALA浓度升高,吞噬活性降低,呈剂量依赖性。荧光显微镜下5-ALA 0.12 mmol/L组细胞内有大量红色荧光。随着5-ALA浓度升高,ROS水平升高,呈剂量依赖性。结论 5-ALA-PDT可对RAW264.7细胞吞噬活性和活性氧自由基产生影响,可能影响5-ALA-PDT的疗效。

橙皮苷通过下调HMGB1抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞MCP-1表达的实验研究

目的探讨橙皮苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用及相关的分子机制。方法将小鼠巨噬细胞系(RAW264.7巨噬细胞)分为对照组(Control组)、LPS组和LPS+橙皮苷组(LPS+HPD组)3组,在干预24小时后使用qPCR法和western blotting法对RAW264.7巨噬细胞MCP-1和HMGB1mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果与Control组比较,在LPS干预24小时后RAW264.7巨噬细胞MCP-1和HMGB1mRNA及蛋白的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05);但LPS组较LPS+橙皮苷组MCP-1和HMGB1mRNA及蛋白的表达增加更加显著,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论本实验结果表明,在LPS诱导的炎症状态下,橙皮苷可能可以通过抑制HMGB1的表达下调RAW264.7巨噬细胞MCP-1的合成和释放。

钛颗粒对RAW264.7巨噬细胞增殖及炎性因子表达的影响

目的观察钛(Ti)颗粒对RAW264.7巨噬细胞增殖及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法 Ti颗粒设0、0.125、0.25、0.5和1 pg·mL^(-1)浓度组,观察RAW264.7巨噬细胞不同时段对各浓度Ti颗粒的吞噬作用;MTT法检测各浓度Ti刺激后RAW264.7巨噬细胞增殖能力;ELISA法检测0.125pg·mL^(-1)Ti刺激RAW264.7巨噬细胞前后分泌TNF-α、MMP-9的变化。结果 RAW264.7巨噬细胞出现吞噬Ti颗粒现象。MTT法检测表明所用各浓度Ti颗粒均不影响RAW264.7巨噬细胞增殖;RAW264.7巨噬细胞在0.125pg·mL^(-1) Ti颗粒的刺激下分别培养6、24和96h均可使NF-α、MMP-9表达增高(P<0.01)。结论 Ti颗粒可引起RAW264.7巨噬细胞吞噬反应,促进TNF-α、MMP-9表达,但不影响RAW264.7巨噬细胞的增殖。

冰片对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型的影响

目的:探究冰片的体外抗炎活性及其相关的分子机制.方法:选取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞,使用不同浓度(0.03μg/mL、0.3μg/mL、3μg/mL、30μg/mL、300μg/mL、600μg/mL)冰片和不同浓度(0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL)脂多糖(LPS)分别作用细胞24h,采用CCK-8法检测细胞活力,筛选出活力较好的冰片和LPS浓度.LPS刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症细胞模型,选择醋酸地塞米松(Dexamethasone,Dex)作为阳性对照药,分别设置空白(KB)组、模型(MX)组、阳性(YX)组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,药物组分别使用相应浓度的药物预处理细胞0.5h后,各组(除KB组)再用LPS刺激23.5h.倒置显微镜下观察细胞形态,一步法测定细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的含量,Westernblot法检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路、核转录因子E2相关因子2(Nrf2)通路及核因子(NF-κB)通路中相关蛋白的表达水平,DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)含量.结果:冰片浓度<600μg/mL和LPS浓度<1.5μg/mL时细胞活力未受明显影响,并进一步优化出1.5μg/mL、15μg/mL、150μg/mL分别作为冰片抑制细胞炎症的低、中、高剂量,1.2μg/mLLPS作为刺激RAW264.7细胞的最佳浓度.倒置显微镜下观察可见,KB组大部分细胞呈圆形,轮廓较为清楚;MX组细胞伪足和肿胀分化较为严重,且胞质内可见白色透明小泡;YX组细胞伪足回缩,趋于正常;冰片三个剂量组均能不同程度地抑制细胞分化.冰片可剂量依赖性地降低炎症因子NO的水平.Western blot结果显示,冰片可激活Nrf2通路,促进Nrf2蛋白表达,同时抑制MAPKs及NF-κB通路活化,降低ERK、JNK、p38和p65的磷酸化水平.冰片可剂量依赖性地抑制ROS的过度表达.结论:冰片可剂量依赖性地抑制MAPKs和NF-κB通路的活化,以及激活Nrf2蛋白,降低相关炎症因子NO的表达水平,进而发挥细胞抗炎活性.

空间诱变菌感染对模拟失重RAW264.7巨噬细胞miR-1224-5p表达的影响及生物信息学分析

目的探讨模拟失重下空间诱变大肠杆菌T1-13感染对RAW264.7巨噬细胞miR-1224-5p表达的影响及其生物学意义。方法采用细胞回转模拟失重,RAW264.7巨噬细胞随机分为对照组(Con)、对照染菌组(Con+T1-13)、模拟失重组(SW)及模拟失重染菌组(SW+T1-13),模拟失重细胞置于回转器回转培养72h,染菌细胞以T1-13刺激6h诱导炎症反应。采用qRT-PCR技术检测各组细胞内miR-1224-5p表达,对其靶基因进行预测并开展Gene Ontology(GO)功能富集、KEGG信号通路分析和STRING蛋白互作分析。结果 qRT-PCR结果表明,与Con组相比,SW+T1-13组RAW264.7巨噬细胞中miR-1224-5p表达显著下调(P<0.05)。生物信息学分析显示,miR-1224-5p靶基因可显著富集于轴突导向、PI3K-AKT、FOXO、Notch、Wnt及MAPK等信号通路;蛋白互作网络中Kras、MAPK8、IL-6、MAPK14、Myc、Stat1、Pik3r1等蛋白处于网络中心位置。结论模拟失重下空间诱变大肠杆菌T1-13感染可导致RAW264.7巨噬细胞中miR-1224-5p表达显著下调,miR-1224-5p可能通过其靶基因参与了炎症相关的分子调控。

青蛤酶解多肽对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

研究酶解法制备的青蛤多肽(Cyclina sinensis peptides,CSP)对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。以RAW264.7巨噬细胞相对增殖率为指标,选用胃蛋白酶对青蛤肉进行酶解,酶解液经超滤、冷冻干燥后,采用噻唑蓝(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)法筛选出增殖活性最高的组分进行免疫调节作用研究。采用MTT细胞增殖实验、倒置显微镜观察、中性红吞噬实验、硝酸根还原酶法及酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定CSP-5对RAW264.7巨噬细胞的生长与增殖、细胞形态、吞噬能力、一氧化氮(nitric oxide,NO)分泌能力及细胞因子白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌能力的影响;同时还研究了CSP-5对巨噬细胞各周期分布的影响。结果表明,分子质量小于3 kDa的CSP-5对RAW264.7细胞的生长与增殖具有明显的促进作用,且主要作用于G0/G1期,对细胞吞噬能力、NO分泌能力和细胞因子分泌能力的提高具有显著的促进效果;形态学观察结果显示经CSP-5作用后巨噬细胞体积变大且长出较多伪足。由此可知,CSP-5具有激活巨噬细胞增强机体免疫力的潜在作用。