肠道病毒71型在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征

目的:利用噬斑法比较肠道病毒71型(EV71)在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征。方法:首先探讨培养基类型、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)及甲基纤维素(MC)含量对EV71噬斑形成的影响,得到最适营养覆盖物配比;进一步,EV71以感染复数(MOI)为0.1分别接种RD细胞和Vero细胞,收集接种后不同时间点的细胞培养液,噬斑法测定各时间点培养液上清中的病毒滴度,并绘制log2(病毒滴度)-时间图,对比分析EV71在2种细胞中的增殖动力学特征。结果:终浓度含1%MC和2%FBS的MEM(1×)或DMEM(1×)为EV71噬斑形成的最适营养覆盖物;EV71在RD细胞和Vero细胞中的增殖周期均约为12 h,MOI=0.1时,EV71在RD细胞中的增殖活动较Vero细胞中活跃,增殖效率比Vero细胞中高2个数量级。结论:用RD细胞扩增EV71比Vero细胞更具优势。

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨苦参碱(Ma)对人横纹肌肉瘤(RMS)细胞RD增殖及凋亡的影响。方法取对数生长期的细胞,分为对照组(无Ma);Ma组:Ma终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL;U0126(MAPK抑制剂)组:U0126为10μmol/L;Ma联合U0126共同作用组:U0126均为10μmol/L,Ma浓度同Ma组;每组设5个复孔。给予相应药物作用后,采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测RD细胞的增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测凋亡率。结果药物作用后显微镜下可见细胞数目减少,细胞变小、变圆,随着Ma作用浓度的增加,RD细胞凋亡细胞逐步增多;Ma与U0126联合作用后,凋亡细胞明显增多,MTT比色法检测其抑制率按分组顺序分别为(13.39±1.13)%、(23.49±0.39)%、(38.84±0.35)%、(48.05±0.82)%、(63.47±1.35)%、(13.91±0.63)%、(24.52±0.46)%、(39.82±0.58)%、(48.98±0.31)%和(65.09±0.85)%;流式细胞仪检测其凋亡率按分组顺序分别为(5.49±0.96)%、(14.23±0.70)%、(25.84±4.17)%、(36.08±3.68)%、(42.53±2.71)%、(6.72±1.52)%、(17.23±3.42)%、(27.83±1.29)%、(38.25±1.44)%和(47.79±1.35)%;除U0126组外,其余各组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。结论苦参碱单独或与U0126共同作用RD细胞,可抑制该细胞的增殖,促进其凋亡,在本实验范围内浓度越高这种抑制增殖、诱导凋亡的作用越明显。

紫杉醇抑制胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞株生长的实验研究

目的探讨紫杉醇对胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞株的抗癌作用及其与诱导凋亡的关系。方法将不同浓度的紫杉醇作用于RD细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法检测其作用的时间效应及剂量效应;在光镜和电镜下观察细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段、用流式细胞仪分析细胞G2?M期分布的改变及凋亡率。结果紫杉醇对体外培养的RD细胞有明显的抑制作用,在一定剂量和时间范围内,其抑制作用呈时间依赖性和浓度依赖性,其24h的半数抑制浓度为(167.4±5.4)ng?ml。100ng?ml紫杉醇作用于RD细胞24h后,透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳可见到典型细胞凋亡特征。流式细胞仪分析显示紫杉醇可使肿瘤细胞出现G2?M期阻滞并诱导细胞凋亡。结论紫杉醇对横纹肌肉瘤RD细胞有明显的生长抑制作用,并且能诱导RD细胞凋亡,可用于横纹肌肉瘤的治疗。

PAX3-FKHR转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及MRF4表达的影响

背景与目的:研究报道融合基因PAX3-FKHR与腺泡型横纹肌肉瘤的发生有着密切的关系,但它对生肌调节因子的作用还不清楚。本研究拟探讨融合基因PAX3-FKHR对胚胎型横纹肌肉瘤细胞分化及MRF4表达的影响。方法:构建PAX3-FKHR的真核表达质粒,采用脂质体法将MRF4、PAX3-FKHR先后转染入人胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞,观察转染前后RD细胞生物学特性、形态学改变以及肌分化标志蛋白MHC、α-actin的表达。结果:RD细胞在转染PAX3-FKHR后细胞的生长速度、生长方式及MHC、α-actin的表达均无显著的变化;在表达MRF4的RD细胞中转入PAX3-FKHR后,细胞MRF4表达无明显变化,细胞形态向低分化方向变化,细胞MHC和α-actin表达显著下降。结论:融合基因PAX3-FKHR转染对培养RD细胞的生物学特性及分化无明显影响,并不影响MRF4的表达,但可逆转MRF4促RD细胞分化的作用。

MyoD转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子表达的影响

目的:观察MyoD转染后对人横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子MRF4表达的影响。方法:利用脂质体法将MyoD转染培养中人横纹肌肉瘤RD细胞,原位杂交检测MyoD、MRF4mRNA的表达,观察细胞形态、生长速度变化,免疫细胞化学检测横纹肌肌球蛋白重链及肌动蛋白α-actin表达。结果:转染后RD细胞形态向高分化方向变化,生长受抑制;MyoD、MRF4表达明显增加;细胞肌球蛋白重链和肌动蛋白α-actin表达显著增强。结论:MyoD具有促进RD细胞分化的作用,并可激活另一生肌调节因子MRF4的表达。

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖凋亡的影响及其作用机制

目的:探讨苦参碱(Matrine,Ma)对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖凋亡的影响及其作用机制。方法:将我组经体外培养的人横纹肌肉瘤RD细胞随机分为实验组和对照组。其中,实验组又分为3个小组且3个小组的细胞中分别加入浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml和1.5mg/ml的苦参碱,对照组细胞中不加入苦参碱。然后应用MTT比色法检测苦参碱对横纹肌肉瘤RD细胞增殖的影响;应用流式细胞仪(FCM)检测苦参碱对横纹肌肉瘤细胞凋亡的影响;应用RT-PCR检测不同浓度苦参碱作用后fas、caspase3等凋亡相关基因的mRNA表达水平。结果:①在抑制RD细胞增殖、诱导RD细胞凋亡方面,实验组和对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组可明显抑制RD细胞增殖、诱导RD细胞凋亡,且作用效果与剂量相关。②将浓度为2.0mg/ml的苦参碱作用于RD细胞24h后,细胞增殖的抑制率和凋亡率分别为(50.49±0.076)%和(39.43±0.487)%。③实验组caspase3和FasmRNA的表达较对照组明显增强(P<0.05)。结论:苦参碱能有效抑制人横纹肌肉瘤RD细胞增殖、诱导人横纹肌肉瘤RD细胞凋亡,且caspase3和FasmRNA等相关基因可能参与了苦参碱抑制RD细胞增殖和诱导RD细胞凋亡的过程。

大蒜素对人横纹肌肉瘤RD细胞的作用及其机制

目的探讨大蒜素(allicin)对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖和凋亡的作用及其相关机制。方法应用不同浓度大蒜素(5,10,20,30μg/ml)作用人横纹肌肉瘤RD细胞株24h,采用MTT比色法检测不同浓度大蒜素下RD细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测不同浓度大蒜素作用后RD细胞的凋亡率。结果 MTT比色法检测各实验组增殖抑制率分别为(25.82±1.75)%、(31.04±1.61)%、(36.32±1.61)%、(42.58±3.88)%;流式细胞仪检测对照组及各实验组凋亡率分别为(5.23±0.80)%、(7.07±0.83)%、(10.60±2.51)%、(15.70±1.79)%、(19.33±0.72)%。以上检测各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大蒜素能有效抑制RD细胞的增殖,诱导其凋亡。

转化生长因子β1对横纹肌肉瘤RD细胞系的生长调节及机制探讨

目的 研究转化生长因子 (TGF) β1对横纹肌肉瘤RD细胞系的生长调节及作用机制。方法 3 H thymidine掺入实验、四甲基偶氮唑盐 (MTT)实验和生长曲线检测经TGF β1处理不同时间的RD细胞生长活力的变化 ;应用流式细胞术检测RD细胞周期的改变 ;激光扫描共聚焦显微镜观察细胞周期抑制蛋白 p15、p2 1和 p2 7在RD中分布的变化 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Westernbolt检测RD细胞中细胞周期抑制蛋白 p15、p2 1、p2 7mRNA和蛋白水平的变化。 结果 TGF β1处理RD细胞后 ,其生长活力明显降低 ,并出现G1期停滞。p2 1,p2 7在mRNA和蛋白水平表达上升 ,且 p2 1由胞核表达改变为胞核胞质内均有表达。p15在mRNA和蛋白水平上均无明显改变。结论 TGF β1对RD细胞具有生长抑制作用 ,促使细胞G1期停滞。TGF β1可在mRNA和蛋白水平上调RD细胞中 p2 1、p2 7的表达。TGF β1可能通过上调p2和 p2 7而非 p15抑制RD细胞生长。

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨苦参碱(matrine,Mat)对体外人横纹肌肉瘤RD细胞增殖和凋亡的影响,以及Mat诱导RD细胞凋亡的相关机制。方法采用MTT比色法检测终浓度为0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL Mat对RD细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测上述4种不同浓度Mat对RD细胞的凋亡作用;RT-PCR法检测终浓度为0.5、1.0和1.5 mg/mL Mat对RD细胞Cyclin D1及Survivin mRNA表达的影响。结果各浓度实验组RD细胞的增殖抑制率和凋亡率均高于未经Mat处理的对照组(均P<0.01),且随着药物浓度增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,呈剂量依赖性。RT-PCR检测Cyclin D1及Survivin mRNA在各组RD细胞中均有表达,两者的表达水平在各浓度处理组中与对照组相比均有明显下降(P<0.01)。其中Cyclin D1在各浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),而Survivin仅在0.5 mg/mL和1.5 mg/mL组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Mat能明显抑制RD细胞的增殖,并诱导其凋亡;其抗肿瘤机制可能与下调Survivin和Cyclin D1 mRNA的表达有关。

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞中X连锁凋亡抑制蛋白表达的影响

目的探讨苦参碱对体外培养的人横纹肌肉瘤RD细胞中X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响。方法体外培养人横纹肌肉瘤RD细胞并分为对照组及0．5g/L、1．0g／L、1．5g／L苦参碱干预组。采用四甲基偶氮唑蓝比色法及流式细胞术分别检测RD细胞在不同质量浓度苦参碱作用下的细胞增殖抑制率及凋亡率的变化，反转录PCR法检测RD细胞中XIAP mRNA的表达。结果不同质量浓度苦参碱干预组及对照组中RD细胞的增殖抑制率[0．5g／L苦参碱干预组：（15．84±2．58）％、1．0g／L苦参碱干预组：（23．13±4．19）％、1．5g／L苦参碱干预组：（30．32±3．02）％、对照组：（8．92±1．23）％]、凋亡率[0．5g／L苦参碱干预组：（12．33±1．15）％、1．0g／L苦参碱干预组：（16．67±0．99）％、1．5g/L苦参碱干预组：（25．33±1．91）％、对照组：（9．47±O．96）％]及XIAP mRNA表达（0．5g／L苦参碱干预组：0．633±0．046、1．0g／L苦参碱干预组：0．441±0．055、1．5g/L苦参碱干预组：0．326±0．065、对照组：0．794±0．029）均有差异，且差异有统计学意义（F=14．15、83．37、50．57，P均〈0．01）。随着苦参碱质量浓度的增加，RD细胞的增殖抑制率及凋亡率明显增加，而心尸mRNA的表达明显降低，且呈剂量依赖性。结论苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用，且该作用可能与下调凋亡抑制基因XIAP的表达有关。

5-aza-2′脱氧胞啶联合组蛋白乙酰基转移酶抑制剂LAQ对体外RD-ES细胞的抑制作用

研究5-杂氮-2'-脱氧胞啶(5aza-CdR)联合组蛋白乙酰基转移酶(HDAC)抑制剂LAQ对体外RD-ES细胞的抑制作用。体外培养人尤文氏瘤细胞株RD-ES,观察不同浓度5aza-CdR联合HDAC抑制剂LAQ对RD-ES细胞的生长抑制作用。本实验表明HDAC抑制剂能增强5aza-CdR对RD-ES细胞抑制作用,且呈量-效关系,LAQ对RD-ES细胞系的IC50值是8 ng/mL,5aza-CdR联合LAQ对体外RD-ES细胞的抑制作用显著,并与瘤抑制基因ECAD和TSLC1的表达密切相关。5-az,a-2'脱氧胞啶联合HDAC抑制剂LAQ对RD-ES细胞生长有明显的抑制作用。

基于RNA-seq技术研究埃可病毒30型感染RD细胞前后的差异表达基因

埃可病毒30型(Echovirus 30,E30)是一种全球传播的B组肠道病毒,常与无菌性脑膜炎等疾病暴发有关,分析E30在感染人横纹肌肉瘤(Human rhabdomyosarcoma,RD)细胞前后的差异表达基因有助于了解该病毒的复制周期以及宿主感染机制。本研究通过转录组测序技术探究E30感染RD细胞前后的基因表达谱变化,共检测到的1281个差异表达基因,其中包括730个下调基因和551个上调基因。基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明,显著差异表达基因主要参与细胞受体信号通路的调节、炎症反应、免疫细胞活化、调控细胞生命周期等。利用荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,qPCR)对其中9个与炎症和免疫反应相关的差异表达基因进行验证,发现DEAD-box解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3,DDX3)表达上调,这与转录组学分析一致。利用RK-33(DDX3的小分子抑制剂)靶向抑制DDX3的表达,发现RK-33能够抑制E30的复制,并且qPCR结果显示在抑制DDX3的表达后,GTP酶激活蛋白结合蛋白1(GTPase-activating protein-binding protein1,G3BP1)和干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor 3,IRF3)的表达也出现不同程度地降低。本研究的结果提示DDX3表达可能影响E30复制,这一发现为进一步探索E30在感染宿主过程中的分子机制奠定基础。

稳定表达HLA-A33蛋白细胞系的建立

旨在构建能稳定表达HLA-A33蛋白的细胞系,并观察其在细胞中的表达水平。首先克隆取得HLA-A33基因,并将其插入慢病毒载体,经酶切和测序鉴定,确定载体构建正确。通过慢病毒系统感染正常RD细胞,将HLA-A33基因整合进RD细胞的基因组。提取构建细胞系的基因组做PCR鉴定,并通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测,结果显示,HLA-A33基因成功整合入RD细胞基因组中,且在重组细胞系中成功表达。该细胞系可为A33等位基因与HBV感染后的慢性化以及EV71感染的相关研究提供试验参考。

高分子量透明质酸抑制横纹肌肉瘤细胞迁移的初步研究

横纹肌肉瘤是一种常见软组织肉瘤,具有恶性程度高,易转移,治疗困难等特点,严重威胁健康。采用细胞划痕试验证明高分子量透明质酸可抑制人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)迁移。进一步采用荧光定量RT-PCR检测不同透明质酸受体表达,结果表明,RD细胞中CD44具有较高表达水平,且高分子量透明质酸处理可下调CD44表达。Western blot检测结果显示高分子量透明质酸可下调CD44及细胞迁移相关蛋白Cdc42和Arp2/3表达。免疫荧光超高分辨显微镜观察结果显示,CD44表达显著下调同时,RD细胞中细胞质膜边缘丝状和分枝状微丝发生解聚,表明高分子量可能通过抑制伪足形成而抑制RD细胞迁移和运动,从而为横纹肌肉瘤疾病治疗提供新思路。

注射用核糖核酸Ⅱ对人横纹肌肉瘤细胞增殖和凋亡的调控作用

目的研究注射用核糖核酸Ⅱ调控人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞增殖和凋亡作用的分子机制。方法注射用核糖核酸Ⅱ与RD细胞作用24 h后,MTT法检测细胞存活率,确定给药浓度;Hoechst 33258、AO/EB染色法检测细胞凋亡;JC-1法检测线粒体膜电位;流式细胞术检测细胞周期分布;Western blot检测细胞增殖与凋亡相关蛋白表达。结果注射用核糖核酸Ⅱ可呈浓度依赖性降低RD细胞存活率,诱导细胞凋亡,并明显降低线粒体膜电位。流式细胞术结果表明,RD细胞复制被阻滞在S期。Western blot结果表明,给药后周期阻滞蛋白p21表达上调,CDK2、CDK4下调,p-Akt、p-JNK下调;凋亡相关因子Bcl-2表达下调,Bax上调,caspase-8、caspase-3含量降低。结论注射用核糖核酸Ⅱ通过激活p21,下调G_1/S期关键蛋白CDK2、CDK4,将RD细胞周期阻滞在S期,抑制Akt、JNK的磷酸化,从而抑制RD细胞增殖;通过下调Bcl-2,上调Bax,破坏线粒体完整性,激活caspase-8、caspase-3,诱导RD细胞凋亡。

柯萨奇病毒B组5型感染的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系lncRNA表达谱分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(CVB5)感染人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系(RD)中差异长链非编码RNA(lncRNA)表达谱,为研究CVB5与宿主之间相互作用分子机制提供参考。方法CVB5按感染复数(MOI)为1接种RD细胞24 h后提取总RNA。采用转录组测序技术获取细胞中lncRNA差异表达谱;通过聚类分析、GO分析和KEGG通路富集对差异表达转录本进行了生物信息学分析。同时,利用RNAfold软件对lncRNA进行了二级结构预测。结果与对照组相比,CVB5感染RD细胞后,共有1754个mRNAs和508个lncRNA呈上调表达,3106个mRNAs和760个lncRNA呈下调表达。差异表达lncRNA的共表达基因主要富集在分子结构活性、蛋白质分子结合和体液免疫反应等生物过程;lncRNA靶基因主要参与嗅觉传导途径、细胞因子受体相互作用和神经活性配体受体相互作用等通路。此外,实时荧光定量PCR验证的7个差异表达lncRNA与测序结果一致。结论CVB5感染RD细胞后,差异显著性lncRNA主要参与了免疫相关过程,为充分理解lncRNA在CVB5感染中的调控作用奠定了基础。

RD、KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较

目的比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒(enterovirus,EV)分离培养的敏感性,以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据。方法收集2019年昆明市某医院确诊手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患者粪便样本60份,分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV,并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对,鉴定EV基因型。结果共分离获得112株EV,分别属于11种基因型。其中RD细胞分离出26株Echo-11,6株Echo-6和Echo-30,2株CV-A4和CV-A10,1株CV-A6、CV-A16和Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2。结论RD细胞对大部分EV均敏感,KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。