次郞甜柿炭疽病菌的分离鉴定及其rDNA-ITS序列分析

为了给生产中柿树次郎甜柿炭疽病的诊断及防治提供理论指导,通过组织分离法和单孢分离法从感病次郞甜柿的果实和嫩梢中获得了2个分离物,菌落及孢子形态特征显示该分离物为炭疽菌。以通用引物ITS6和ITS4,通过PCR扩增,获得了rDNA-ITS基因片段。测序结果显示,从柿的果实和嫩梢分离获得的染病次郎甜柿分离物ITS序列完全一致,片段大小为598 bp,该片段与感病浙江无核柿(AY787483)和新西兰分离物(GQ329690)的同源性分别为100%和99.8%。系统进化树分析结果显示,染病次郎甜柿分离物与浙江无核柿(AY787483,AY791890)和新西兰分离物(GQ329687,GQ329688和GQ329690)处在同一分支,据此,将该病原物鉴定为柿树炭疽菌Colletotrichum horii,并将其ITS基因序列提交到GenBank数据库(基因登录号:JQ957543)。

rDNA-ITS序列分析鉴定块菌伴生真菌

分离攀枝花地区野生块菌伴生真菌,经PCR扩增其rDNA-ITS序列,测序并分析其序列信息,初步鉴定了7种块菌伴生真菌.系统进化树分析将供试真菌分为3大类群:植物腐生真菌、动物病原真菌及植物内共生真菌.

中国红麻炭疽病病原菌的分离鉴定及rDNA-ITS序列分析

【目的】明确中国红麻炭疽病病原菌种类。【方法】从河南、安徽、浙江、福建4省红麻主产区采集红麻炭疽病病原菌样本,进行分离、纯化,共获得16个菌株,在致病性测定及形态学特征鉴定的基础之上,从中选取AH、HN、ZJ、FJ 4个典型病原菌菌株,对rDNA-ITS区域进行基因序列分析。【结果】AH、HN、ZJ与FJ炭疽病菌株在形态特征及致病力有明显差异;rDNA-ITS序列实际长度分别为541、545、541、535 bp,AH、HN、ZJ与FJ炭疽病菌株同源性达90%—91%,而AH、HN和ZJ 3个菌株的同源性达96%—98%。【结论】从分子水平上对中国麻区红麻炭疽病病原菌种类进行鉴定分析,证实中国红麻主产区近年炭疽病发生的病原菌类型主要有黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)和胶孢炭疽菌(C.gioeosporioides),其中以黑线炭疽菌致病力较强,胶孢炭疽菌致病力较弱。

浙江4地桃花水母的rDNA-ITS序列分析

采用PCR和DNA测序技术,对浙江省4个地点桃花水母(Craspedacusta)的核糖体RNA基因内转录间隔区(rDNA-ITS)进行了扩增与测序,并与GenBank中已有的桃花水母ITS区基因序列进行比对分析,计算了它们的遗传距离,利用MEGA 4.1构建了系统发育树。结果显示:这4个地点的桃花水母与索氏桃花水母(Craspedacusta sowerbyi)的ITS区基因相似度极高,同源性都在97%以上,遗传距离保持在0～0.008之间,在进化树中与索氏桃花水母聚为同一支。研究结果表明,这4地的桃花水母都属于索氏桃花水母(C.sowerbyi)。

巴戟天与常见混伪品的rDNA-ITS序列分析及其分子鉴定

目的比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNA-ITS碱基序列的差异及其规律,同时为巴戟天及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记.方法对巴戟天及其常见混伪品的rDNA-ITS进行了PCR扩增、测序,并运用CLUSTAL X、MEGA软件对该区进行序列分析.结果测定了巴戟天及其混伪品的rDNA-ITS区序列,包括ITS1、5.8S和ITS2全长序列以及18S、26S部分序列.巴戟天与假巴戟天、羊角藤在ITS1和ITS2区的差异性分别为2.9%～5.8%和2.9%～4.2%,而与虎刺在ITS1和ITS2区的差异性则为21.2%和18.9%.根据ITS序列特征构建的系统树,混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类,然后与巴戟天聚在一起,而虎刺则单独聚为一支.结论rDNA-ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法.

剑麻茎腐病菌的rDNA-ITS序列分析

应用核糖体rDNA-ITS区的序列分析研究13个不同地区来源的剑麻茎腐病菌,测序结果表明,参试菌株的ITS扩增区约600 bp,无太大的长度变异,同时通过在GenBank中搜索其同源性序列并构建它们的系统发育树,结果表明,引起剑麻茎腐病的病原为黑曲霉菌Aspergillus niger。

节瓜及近缘葫芦科作物种质资源rDNA-ITS序列分析与系统进化研究

通过PCR扩增获得了56份节瓜种质资源及7份相关瓜类种质资源的rDNA-ITS序列,测序后结合GenBank中34份葫芦科作物的ITS序列,利用生物信息学软件分析序列长度、变异位点、G＋C含量、遗传分歧、同源性百分比差异、系统进化关系。节瓜种质资源ITS基本序列全长612-617 bp,G＋C含量59.97%-61.07%,供试材料间共96个变异位点,其中一些变异位点有明显的种性特征,可作为特异DNA指纹鉴别位点。基于ITS序列差异,56份节瓜材料聚为5大类,其中12-2-3材料为单独一个分支,黑毛节瓜H2251为第二分支,H5FA为第三分支,剩余节瓜材料聚为第四、五分支。节瓜材料12-2-3与其他材料遗传分歧最大,农艺性状与抗性也差异较大,可用作节瓜杂交育种的亲本以扩大选择范围。节瓜的系统位置排列在Indomelothria blumei（GU799496）与Dactyliandra welwitschii（HQ201973）之间,与Indomelothria blumei亲缘关系最近;Mrbayes软件分析表明,葫芦科作物Zehneria thwaitesii（AM981145）、Ctenolepis cerasiformis（AM981142）、Cucumis melo（AM36377）、Dactyliandra welwitschii（HQ201973）、Trochomeria macrocarpa（AM981141）最原始,系统进化顺序为甜瓜→南瓜、栝楼、苦瓜、丝瓜、西瓜、蒲瓜→冬瓜、节瓜→黄瓜。本研究通过分析节瓜及近缘葫芦科作物种质资源的ITS序列,为其系统进化、DNA指纹鉴别、育种亲本选择及比较组学分析等提供了分子生物学依据。

豇豆根腐病病原分离鉴定及其核糖体rDNA-ITS序列分析

采用形态学及分子生物学的方法对采集自武汉的豇豆根腐病分离物进行形态学和分子生物学鉴定。结果表明,菌株JGF形态学上为茄腐皮镰孢菌;对JGF菌株的核糖体RNA基因内转录间隔区(rD-NA-ITS)进行了PCR扩增和序列测定,并在GenBank中进行了Blast搜索和比对分析,根据rDNA-ITS序列分析结果结合豇豆病株症状和病菌的形态学特征,认为武汉地区豇豆根腐病的病原菌为茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani Schl.)

腐烂茎线虫rDNA-ITS序列分析

利用一对通用引物rDNA1/rDNA2扩增6个腐烂茎线虫供试群体的rDNA-ITS区域,获得序列长度不等的片段。Des-1、Des-2和Des-3群体扩增片断长度均为1130bp。而Des-5、Des-6和Des-7群体的扩增片段长度均为942bp,与以上群体相比,在ITS区具有一个188bp的缺失片段。序列比对后确定缺失片段位于ITS1区,而且该片段含有多个可重复小片段,这可能是造成碱基缺失的原因。根据遗传进化分析可将供试线虫分为两个大的群体。

核桃种质资源rDNA-ITS序列分析

本研究以9份核桃属种质资源为材料,利用设计引物对其ITS区段进行PCR扩增和测序。利用Dnasp 5.0和MEGA 6.0软件分析ITS序列特征,寻找差异位点,并构建系统发育树。结果显示,9份材料的ITS区段在644～647 bp之间,存在48个变异位点,转换和颠换的比值为1.75。系统发育树结果表明,野核桃和核桃楸亲缘关系最近,最先聚在一起,再与麻核桃聚为核桃楸组,与传统分类学一致。本研究为发掘和利用核桃属种质资源奠定了理论基础。

水蛭及其近缘物种的rDNA-ITS序列分析

目的:通过分析比较入药水蛭及近缘物种的ITS基因片段,探讨其作为分子手段应用于种类鉴定,同时应用此分子标记来分析水蛭的亲缘关系,为研究其系统发育和完善分类系统提供参考。方法:对宽体金线蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、湖北牛蛭、棒纹牛蛭、八目石蛭进行总DNA提取,PCR扩增测序,应用软件分析ITS片段长度、(A+T)%含量、变异位点和进化关系。结果:得到总长度为948～981bp的ITS序列片段,序列中G+C碱基比例较高,为56.0%～57.8%。整个ITS基因片段存在210个碱基变异位点和43个碱基插入/缺失,相对较为保守。石蛭科石蛭属八目石蛭与医蛭科牛蛭属棒纹牛蛭的分类地位较近,遗传距离为0.007;而黄蛭科的3个种与医蛭科的4个种在构建系统发育树时能明显地分为2大支。结论:ITS序列片段分析结果支持黄蛭科和医蛭科现在的分类地位,而八目石蛭与棒纹牛蛭似乎未达属间差异,其分类地位有待进一步探讨。

辽宁省辣椒土传病害镰刀菌鉴定及rDNA-ITS序列分析

[目的]对分离的辣椒镰刀菌形态、基因序列进行研究,以确定病原菌的种类及这些菌的同源性,为进一步开展该病害诊断和防治研究奠定基础。[方法]对采自辽宁省各地辣椒土传病害的16株病菌进行形态观察及rDNA-ITS序列分析。[结果]引起辽宁省辣椒土传病害的主要镰刀菌有尖镰孢、茄镰孢、锐顶镰孢和串珠镰孢等4种,根据菌株分生孢子形态和rDNA-ITS序列同源性,将ZW13、LY3、PJLJ、HC5、CY2、CY5、TLLJ、LY5、LY1菌株聚类为尖镰孢;FSLJ2和FSLJ3菌株聚类为茄镰孢;ZW和ZW18菌株聚类为锐顶镰孢;KPLJ、LZLJ、FSLJ1菌株聚类为串珠镰孢。[结论]从分子系统树和菌株间的遗传距离看出镰刀菌同种同源性都很高,不同种之间同源性相对较低,种间遗传差异较大。

乳白石蒜rDNA-ITS序列分析及种内系统发育研究

对来源于不同产地的11个乳白石蒜(Lycoris albiflora Koidz.)种源的rDNA-ITS序列进行了扩增、纯化、克隆、酶切和测序,并对各种源的rDNA-ITS序列长度、G+C含量、碱基差异和遗传距离进行了比较分析,构建了系统发育树。结果表明,乳白石蒜11个种源的rDNA-ITS序列具有较高的同源性,但不同种源间的ITS序列长度和碱基变异较大;乳白石蒜rDNA-ITS序列总长度约为700 bp,共有318个变异位点;ITS1、ITS2和5.8S rDNA片段长度分别为222～245、240～252和163 bp;ITS序列中的G+C含量均明显高于A+T含量,ITS1和ITS2片段中的G+C含量分别为53.8%～70.5%和63.4%～73.4%;碱基变异类型多为颠换、转换、插入和缺失。种源间的遗传距离差异较大,其中浙江天目山种源(TM3)与浙江宁波种源(NB2)的遗传距离最小(0.000),其他种源间遗传距离为0.067～0.323。基于ITS序列分析结果可将11个乳白石蒜种源聚为3大类,第1类包括采自浙江天目山(TM1和TM2)和浙江宁波(NB3)的3个种源,花和花丝多为白色;第2类包含来源于不同产地的7个种源,花多为乳白色或乳黄色;第3类仅有采自浙江兰溪(LX)的1个种源,花色变异较大。研究结果表明,乳白石蒜种内有丰富的遗传变异,种源间的ITS序列差异与花的特征变化一致,但与地理分布并不相关;rDNA-ITS序列分析可用于乳白石蒜的亲缘关系、物种鉴别和遗传多样性研究。

三七圆斑病致病菌的rDNA-ITS序列分析及杀菌剂对其室内毒力测定

目的:在分子水平上进一步确定三七圆斑病致病菌,同时在室内筛选抑制三七圆斑病致病菌的化学杀菌剂。方法:利用病原菌的rDNA构建系统发育树来确定病原菌的分类地位;采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定11种化学杀菌剂原药对三七圆斑病致病菌的抑制作用。结果:系统发育分析表明,供试三七圆斑病致病菌为槭菌刺孢Mycocentrospora acerina。化学药剂对菌株BH19-2菌丝体的抑制试验作用结果表明,95%福美双的EC50值最低,仅为3.2365 mg/L;其次为95.1%氟硅唑,EC_(50)值为7.5097 mg/L;而97%多菌灵和97.5%苯酰菌胺的EC50值均在15000 mg/L以上。孢子萌发抑制作用试验结果表明,98%百菌清、95%福美双、90%代森锰锌和95.1%氟硅唑对菌株BH19-2分生孢子萌发的EC_(50)值均小于10 mg/L,而97.5%苯酰菌胺的EC50值最大,达到14837.4635 mg/L。结论:在分子水平上证明供试菌株BH19-2、PL3-1-1和BH19-19均为Mycocentrospora acerina;95%福美双和95.1%氟硅唑对三七圆斑病致病菌的菌丝生长和孢子萌发都有较好的抑制作用,可以作为田间药效试验研究的备选农药。

11份蜜环菌种质rDNA-ITS序列分析

本研究以收集自贵州省(贵州大学农学院M-01~M-07、都匀市M-08、凯里市M-09和福泉市M-11)和湖北省宜昌市(M-10)的11份蜜环菌种质为研究对象,提取其基因组DNA,采用通用引物ITS4/ITS5对核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)进行扩增,利用DNAMAN软件对11份蜜环菌种质进行构建同源树并分析其序列特征,采用MEGA软件最近邻距法进行系统发育分析及遗传距离的计算。结果表明,11份蜜环菌种质可分为两个大类4个亚类,第Ⅰ-Ⅰ类包括M-01、M-02、M-04、M-05和M-08-M-10,第Ⅰ-Ⅱ类为M-03,第Ⅱ-Ⅰ类包括M-06和M-07,第Ⅱ-Ⅱ类为M-11,具有较强的同源性(93%);两个大类样品的特征序列均位于ITS1和ITS2区表现为碱基的转换或颠换;共有序列的相似度为88.71%在ITS区存在丰富的变异表现为碱基的转换、颠换和缺失,第Ⅰ类的GC含量(44.2%)高于第Ⅱ类(42.6%);种内遗传距离均为0,第Ⅰ-Ⅱ类和第Ⅱ-Ⅱ类的种间遗传距离最小(0.002),第Ⅱ-Ⅰ类和第Ⅱ-Ⅱ类的种间遗传距离最大(0.035);经NCBI数据库BLAST对比及系统发育分析这4个亚类的样品均不能与下载的蜜环菌归为一支。因此,11份密环菌种质可能是一个较为庞大的复合群,采用通用引物ITS4/ITS5扩增的核糖体基因可以对此类蜜环菌进行分类但不适合作为鉴定的持家基因。

猕猴桃果实贮藏期主要真菌病害的rDNA-ITS鉴定及序列分析

【目的】对陕西省周至县猕猴桃主栽品种‘华优’、‘海沃德’及‘秦美’贮藏期霉烂果实中的病原菌进行分离与鉴定,分析比较病原菌rDNA-ITS序列的差异和种内与种间群体分化状况,确定优势菌,为病害防治提供依据。【方法】采用病原菌形态鉴定与rDNA-ITS鉴定相结合的方法,确定引起猕猴桃霉烂的病原菌种类;通过构建系统发育树,分析病原菌种之间的亲缘关系。【结果】从贮藏期霉烂的猕猴桃果实中共分离出30株病原菌,主要为青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、交链孢霉属(Alternaria)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Simplicillium)等5个属。其中青霉属(Penicillium)19株占63.3%,为优势菌,包括Penicillium sp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum、Penicillium purpurogenum和Penicillium commune;木霉属(Trichoderma)8株占26.7%较次之,包括Trichoderma longibrachiatum和Trichoderma sp;交链孢霉属(Alternaria)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Simplicillium)各1株,各占3.3%;聚类分析表明,30株病原聚为五大类群。【结论】引起陕西省周至县‘华优’、‘海沃德’和‘秦美‘猕猴桃贮藏期果实霉烂优势病原菌为Penicillium sp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum、Penicillium purpurogenum和Penicilliumcommune;rDNA-ITS区序列在青霉菌属内种间差异鉴别具有较高的参考价值。

6个相似穿孔线虫种群的形态特征及rDNA-ITS序列分析

运用光学显微镜对相似穿孔线虫进行观察及测量其主要特征;采用线虫通用引物18S和28S对6个相似穿孔线虫种群进行rDNA-ITS区进行了序列扩增,获得片段长度大约850 bp,克隆测序后使用UPGMA法进行聚类分析和构建系统发育树。结果表明：6个相似穿孔线虫的相似度高达99.3%,其中1RS、2RS、3RS和6RS 4个种群与来自台湾的KJ845638.1、广州的KF234224.1和马来西亚半岛的FJ455830.1在一个小类群中,表明它们之间的亲缘关系较近;而4RS和5RS种群在另一个小类群中。本研究为深入相似穿孔线虫不同种群间的形态差异与系统发育关系、及两者之间的关系等研究提供科学的理论依据。

橡胶树炭疽病菌rDNA-ITS区序列分析

应用核糖体rDNA-ITS区的序列分析研究18个不同地区来源的橡胶树炭疽病病原菌。结果表明:测试菌株的ITS扩增区(ITS3-ITS4)约为300bp,无太大的长度变异。ITS核酸序列聚类分析的结果表明:18个测试菌株被聚为2个类群,群与群之间差异不明显,2组之间同源率大约为99.3%,通过在NCBI网站的blast比对分析,结果显示2组均为胶孢炭疽菌(Colletrichum gloeosporioides)。

9种热区植物白粉病菌的rDNA-ITS序列及系统发育分析

为弄清橡胶树、野艾蒿、大尾摇、胡萝卜、车前草、马占相思、红木、苦瓜和九里香等热区植物上白粉病菌的种类和彼此之间的系统发育关系,对这些白粉病菌的rDNA-ITS序列进行扩增和测序,与GenBank上公布的序列进行同源性比对,并进行分类。结果表明:橡胶树、马占相思、红木和九里香上的白粉病菌相似性非常高,均在99%以上;野艾蒿、大尾摇和苦瓜白粉病菌与叉丝单囊壳白粉菌的亲缘关系较近,分别达到100%和99%;胡萝卜白粉病菌与白粉菌属的独活白粉菌相似性在99%以上;而车前草白粉病菌与污色白粉菌的相似性达100%。利用供试菌和GenBank上公布的rDNA-ITS序列构建了系统发育树,将供试白粉菌分为4个类群,确定供试白粉菌之间的亲缘关系。

云贵两省三地牛带绦虫核糖体rDNA-ITS1序列分析

目的：采用PCR克隆测序方法，对采自贵州省都匀、从江及云南省大理三地牛带绦虫，与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种标本进行比较，为贵州都匀、从江及云南大理牛带绦虫标本鉴别提供分子生物学证据，并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种分类学地位。方法：取贵州都匀株、贵州从江株、云南大理株和台湾桃园株成虫节片，抽提DNA，PCR扩增rDNA-ITS1区段，克隆测序；结合GenBank中已知猪带绦虫rDNA-ITS1序列，构建系统发育树。结果：贵州都匀、云南大理牛带绦虫标本、台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的ITS1序列基本一致，同源性达98％～99％；贵州从江牛带绦虫标本ITS1序列与前三者有30个碱基差异，与台湾桃园、贵州都匀和云南大理同源性均为97％。系统发育树显示：贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本与台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的遗传距离最接近，距贵州从江牛带绦虫标本较远，与猪带绦虫则更远。结论：（1）贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本属于牛带绦虫亚洲亚种，贵州从江牛带绦虫标本属于传统牛带绦虫。（2）rDNA-ITS1序列分析可以用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学研究。