基于TaqMan探针的Real-timePCR定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。

半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIMEPCR分析

以甘蓝型油菜陇油2号子叶为转化受体材料,通过农杆菌介导将半夏凝集素抗虫基因(pta)导入陇油2号,经常规PCR检测获得阳性植株3株。以油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pep)作为内参基因、选pta全长序列中高度保守区域中145bp的pta2为目的片段对转基因植株进行REAL-TIMEPCR分析,初步证明外源pta基因已整合到油菜细胞基因组中。

Real-timePCR在GB/T 4789.4-2010中的应用

通过应用Real-timePCR检测,提高沙门氏菌的检出率;同时简化实验程序,减少工作量,为可能发生的食物中毒尽早提供实验依据。选取2014、2015年国家食品风险监测标本。标准组按照GB/T 4789.4-2010进行沙门氏菌检测;实验组取GB/T 4789.4-2010中规定的第一次增菌液进行Real-timePCR,若阳性继续按照GB/T 4789.4-2010后续步骤检测,若阴性则直接报告结果。共检测370个标本,共检出沙门氏菌5株,标准组与实验组检测结果一致,符合率100%。通过应用Real-timePCR,可以为目的菌检出提供导向作用,有助于提高其检出率;对于PCRReal-timePCR阴性的标本,可提前3-4d直接报告,缩短了实验周期;由于后续只针对Real-timePCR阳性标本进行检测,减少了实验者的工作量,节约了阴性标本后续检测的实验试剂。

长期施肥对红壤性水稻土细菌群落结构和数量的影响

【目的】通过对土壤细菌数量和多样性的研究,揭示长期不同施肥制度对土壤微生物生态的影响规律,为中国稻田土壤科学施肥、维护健康土壤微生物生态系统及农业可持续发展等方面提供重要理论和实践依据。【方法】采用末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)和实时定量(real-time)PCR方法,研究湖南省望城县施用化肥(NPK)和秸秆还田(NPKS)对水稻土细菌群落结构及其多样性和数量的影响。【结果】T-RFLP分析结果表明红壤性水稻土细菌的优势类群为变形菌(150 bp;相对丰度33%—37%)和放线菌(67 bp;相对丰度20%—25%),施肥对土壤细菌群落结构及其多样性产生了显著影响。典范对应分析(CCA)表明不同处理间细菌群落结构差异显著,而土壤pH和有机碳是影响土壤细菌群落结构的主要因子。多样性指数分析(香农指数和均匀度指数)显示秸秆还田处理的土壤细菌多样性最高,施肥处理(氮磷钾配施和秸秆还田)的土壤细菌多样性均高于不施肥处理。通过实时PCR技术定量了3种施肥处理的土壤细菌数量(4.34×1010—10.94×1010个拷贝16S rDNA每克土),与不施肥相比,施肥后土壤细菌数量增加了50%—100%。【结论】长期施肥对红壤性水稻土细菌群落结构及其多样性和数量均产生了深刻的影响,长期化肥和秸秆还田,土壤质量和土壤肥力提高,土壤细菌种群多样性和数量显著增加。

福辛普利对糖尿病视网膜病变小鼠血管紧张素转化酶2和血管内皮生长因子的影响

目的 探讨福辛普利(Fos)对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病视网膜病变(DR)小鼠的保护作用,及其对DR小鼠血管紧张素转化酶2(ACE2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 48只健康雄性昆明小鼠随机抽取36只,高脂饲料喂养6周后用SZT诱导制作糖尿病小鼠模型。模型制作成功后随机分为3组:模型组、Fos低浓度(5 mg/kg)组和Fos高浓度(10 mg/kg)组。12只小鼠为对照组。连续给药8周后,观察各组小鼠体质量和血糖变化,通过视网膜组织HE染色观察视网膜结构变化,采用ELISA法测定小鼠血清VEGF水平,运用免疫组织化学法观测小鼠视网膜组织ACE2的表达,Real-time PCR检测小鼠视网膜ACE2 mRNA表达,Western blotting检测小鼠视网膜ACE2和VEGF蛋白水平。结果 Fos(5 mg/kg和10 mg/kg)能够显著减轻糖尿病小鼠视网膜内界膜层新生血管增生,下调糖尿病小鼠升高的血清中VEGF表达,促进糖尿病小鼠视网膜组织ACE2表达,Fos高浓度组作用效果较低浓度组好(P<0.05)。结论 福辛普利对糖尿病小鼠视网膜病变有保护作用,这种保护作用可能与上调ACE2的表达,降低VEGF表达有关。

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应,关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术,从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3,其全长750bp,编码区长501bp,编码166个氨基酸,含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现,TaLEAL3属于第3组LEA蛋白,序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示,TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上,主要在茎中表达,而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明,在干旱、低温和ABA诱导下,TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7kb序列处,预测具有启动子的核心序列和增强子序列,及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能,初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。

鸭GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立鸭GAPDH基因的real-time PCR技术,为鸭功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础.根据GenBank中鸭GAPDH基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的real-time PCR方法.结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点.研究结果为鸭GAPDH作为内参基因用于鸭相关基因定量表达分析奠定了基础.

水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的RNAi研究及表达分析

在图位克隆获得目的基因OsCSLD4的基础上,利用Invitrogen公司的Gateway系统将500bp的OsCSLD4基因cDNA编码序列以反向互补的方式插入pANDA35HK,构建了水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的干涉载体pANDAH05。利用农杆菌转化法将干涉载体pANDAH05及对照空载体pANDA35HK分别转化突变体原始亲本日本晴幼胚。转基因阳性植株表型观察结果显示:干涉载体pANDAH05转化日本晴幼胚后,T0代植株出现了类似于突变体1ah137的表型,叶片明显变窄,卷曲程度增加,株高降低;对照空载体pANDA35HK转化日本晴幼胚后,T0代植株仍保持野生型表型;Real-timePCR检测结果显示:日本晴转干涉载体pANDAH05后,目的基因表达量明显降低,干涉强度不同目的基因表达量降低程度不同,研究结果表明目的基因OsCSLD4在水稻叶片形态发育过程中起着非常重要的作用。

组织蛋白酶对成年绵羊卵母细胞体外发育能力的影响

本研究旨在观察绵羊卵丘细胞中组织蛋白酶(CTSS、CTSB)的mRNA在体外成熟过程中的表达规律,探明卵丘细胞中组织蛋白酶(CTSS、CTSB)mRNA的表达与卵母细胞体外发育能力之间的相关性。采用Rea-ltimePCR方法检测绵羊在体外成熟0、8、16和24h的卵丘细胞中组织蛋白酶(CTSB、CTSS)的mRNA表达水平,以及在成熟液中添加组织蛋白酶抑制剂(E-64)后卵丘细胞中CTSB和CTSS的mRNA表达量在体外成熟前及体外成熟后的表达水平,并测定在成熟液中添加1、5、10μmol.L-1 E-64对卵母细胞成熟率、受精率及囊胚发育率的影响。结果,卵丘细胞中的CTSS和CTSB mRNA表达均随着体外成熟时间的增加(IVM 0h、IVM 8h和IVM 16h)呈下降的趋势(P<0.01)。添加5和10μmol.L-1 E-64组的卵丘细胞中CTSS和CTSB mRNA表达水平较对照组和1μmol.L-1组均显著性降低(P<0.01),而5和10μmol.L-1组间的CTSS和CTSB mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)。成熟液中添加5和10μmol.L-1的E-64组的囊胚发育率(26.82%和30.95%)显著高于1μmol.L-1组和对照组(18.23%和15.63%,P<0.05),但5和10μmol.L-1组对卵母细胞的成熟率及卵裂率与1μmol.L-1组和对照组间无显著性差异(P>0.05)。结果表明,绵羊卵丘细胞中CTSS和CTSB的mRNA表达水平在体外成熟过程中呈下降趋势,其mRNA表达水平与胚胎的发育能力呈负相关;组织蛋白酶特异性抑制剂E-64可下调绵羊卵丘细胞中CTSS和CTSB的mRNA表达水平,并提高卵母细胞随后的体外发育能力。

由ACC合成酶反义基因转化所得枣树其RNA表达量的测定

利用real timeRT PCR对转基因枣树中的anti ACSG的RNA表达量进行了定量测定.样品扩增产物荧光量随着扩增循环数的增加而呈现"S"形增加;经熔解曲线分析,其扩增产物中未检出非特异性产物和引物二聚体;扩增产物的CT值和模板cDNA起始浓度两者之间呈线性相关(R2=0.9929);转化体中anti ACSGRNA表达量约为4500～10300拷贝/g组织.

利用Affymetrix芯片分析民猪冷应激后肌肉组织的基因表达谱

冷应激可引起动物生产性能下降,诱发多种疾病,甚至造成死亡。民猪是我国北部地区特有的一个抗寒品种,为了研究冷应激下基因的表达调控机制,本研究利用Affymetrix猪基因芯片对民猪冷应激后肌肉组织内表达发生变化的基因进行了高通量的检测。结果,共检测到差异基因34个,其中下调表达的基因27个,上调表达的基因7个。在下调表达的基因中有7个(OAS1、IRG6、ISG20、DDX58、IFITl、ISG15、CXCL9)与干扰素诱导相关,1个(FST)与生长性状相关,2个(MX1、PG-2)与抗病毒有关,2个(S100A9、Numb)与细胞生长和凋亡有关;上调表达的基因功能还不清楚,推测它们可能与提高机体的抗寒性有关。对其中5个基因进行了Real-time PCR分析,证实它们都受到了温度的调节,与芯片检测结果吻合。结果提示,重度冷应激会造成机体免疫力下降,生长减缓。

仔猪BPI基因表达水平与大肠杆菌F18菌株感染的关系

文章利用已建立的苏太猪F18大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系群体作为实验材料,分别选择8头35日龄左右生长性状基本一致的大肠杆菌F18菌株抗性和敏感性断奶仔猪,运用Real-time PCR方法检测BPI基因mRNA在断奶仔猪各个组织的分布情况,并比较其在大肠杆菌F18菌株抗性型和敏感型断奶仔猪个体间的差异表达水平,为探讨该基因在免疫和抗大肠杆菌F18菌株感染中的作用提供依据。结果表明,在对所有个体检测的11个组织中,BPI基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结中几乎不表达,或表达量很低,但在十二指肠和空肠中表达量很高。在十二指肠和空肠中,BPI基因在抗性组的表达量均显著高于敏感组的表达量(P<0.05)。由此表明,BPI基因对抗断奶仔猪肠道中大肠杆菌F18菌株的感染可能具有直接作用,并且个体对大肠杆菌F18菌株的抗性可能与BPI基因在肠道中表达量上调有关。

肺癌组织中Cyr61、WISP-1基因表达及意义

目的研究人肺癌组织中Cyr61和WISP-1的基因表达水平及其与临床参数的关系。方法采用real-time PCR和免疫组织化学染色法对60例肺癌患者的肺癌组织和癌旁正常肺组织Cyr61和WISP-1表达水平进行测定。结果癌组织中Cyr61表达水平低于癌旁正常肺组织,WISP-1表达水平高于癌旁组织(P均<0.05);Cyr61水平与病理类型、病理分级、转移、吸烟及家族史等相关(P均<0.05),WISP-1与病理类型和年龄相关(P均<0.05)。结论Cyr61和WISP-1在肺癌的发展中起重要作用;其表达的蛋白产物可作为临床早期诊断和干预治疗的重要指标。

黄瓜矮化突变体膨胀素Cs-EXPA2基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR的方法克隆了黄瓜矮化突变体中膨胀素Cs-EXPA2基因,并对其苗期88h内生长过程中mRNA水平表达量的差异进行了研究,探讨膨胀素基因对矮化的影响与作用。结果显示,Cs-EXPA2在黄瓜矮化突变体的下胚轴、根、子叶中均有不同程度的表达,利用Real-timePCR分析得出Cs-EXPA2的表达量随时空变化,Cs-EXPA2在下胚轴中的表达模式为"低-高-低",在根中的表达模式为"高-低-高"。

应用SYBR GreenI的Real-time PCR方法定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态(Viablebutnonculturable,VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。本文基于LightCycler为平台,利用SYBRGreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立一种Real-timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时,发现所有空肠弯曲杆菌(11株)都呈阳性,所有其它弯曲菌(3株)和其它菌株(5株)都是阴性。整个检测过程60min内可以完成,检测限度为5CFU,标准曲线的相关系数为1。结果表明基于SYBRGreenI的定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。

初发SLE病人Th1/Th2及调控因子IL-18基因研究

目的：探讨未经药物治疗初发狼疮病人Th1/Th2细胞亚群分布及其调控细胞因子、细胞因子受体基因表达的差异，试图揭示系统性红斑狼疮发病的免疫紊乱机理。方法：运用三色荧光标记法流式细胞术检测42例未经药物治疗初发狼疮病人细胞亚群分布，并以10例正常人作对照；ABI7700 real-time PCR法同时检测 38例未经药物治疗初发狼疮病人和 28例正常人IL-18及其受体mRNA表达水平的差异。结果：①初发狼疮病人Th1较正常人明显减低（P<0．05），但Th1/Th2无显著性改变。②与正常组相比，SLE组病人IL-18 mRNA及其受体表达较正常人明显降低（P<0．05）；③面部红斑组病人Th1/Th2较正常人明显降低（P<0．05）；④关节炎组SLE病人较无关节炎病人IL-18表达降低。结论SLE是一种以Th1细胞下降，Th2细胞相对占优势的免疫介导的自身免疫性疾病，源于诱导向Th1细胞分化的IL-18及其受体减少和细胞因子间失衡所致。

辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞Wnt信号通路相关因子表达的影响

背景:辛伐他汀作为降脂类药物,具有一定的潜在促骨形成作用,并因此成为骨代谢领域的研究热点,但在体内试验中对其促进成骨的作用尚存争议。目的:观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖﹑分化的影响,及其在此过程中Wnt信号通路相关因子mRNA表达水平的变化。方法:6周龄雌性SD大鼠36只随机分成2组:对照组每天蒸馏水灌胃;实验组辛伐他汀灌胃20mg/(kg·d)。分别于给药后3,6,9周处死两组大鼠各6只,取左侧股骨行骨密度测定;取右侧股骨和胫骨骨髓细胞向成骨方向诱导培养,于细胞培养第16天检测碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色;细胞培养第21天提取总RNA,采用Real-timeRT-PCR检测LRP-5、Axin2、β-catenin的mRNA的表达。结果与结论:辛伐他汀体内给药干扰3,6,9周后大鼠骨密度均无显著变化,体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、成骨分化能力与对照组相比差异均无显著性意义。辛伐他汀体内给药3,6,9周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的分化及LRP-5、Axin2、β-cateninmRNA表达无显著作用。

PTP4A1在舌鳞癌组织及TCA8113细胞中的表达及意义

目的:检测PTP4A1基因在舌鳞癌组织及舌鳞癌细胞系TCA8113中的表达,并探讨其表达水平与舌鳞癌临床病理参数的关系。方法:应用免疫组化SP法检测30例舌鳞癌和15例正常舌组织石蜡包埋组织中PTP4A1的表达;对15例新鲜舌鳞癌组织进行real-time PCR,检测PTP4A1在舌鳞癌组织、癌旁组织、正常舌组织的表达,此外对TCA8113细胞中PTP4A1的表达水平也进行了检测。结果:免疫组化结果显示,PTP4A1表达于舌鳞癌组织的细胞质和细胞核,在舌鳞癌组织中呈阳性和强阳性表达,而在正常舌组织中呈阴性和弱阳性表达;PTP4A1在舌鳞癌的阳性表达率为83%,显著高于其在正常舌组织中的表达率33.3%;PTP4A1在舌鳞癌组织和正常舌组织的表达差异有统计学意义(P=0.001<0.05);而且PTP4A1的表达水平与肿瘤的淋巴转移相关(P=0.014<0.05),而与病人的性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤的分期分级无明显相关。Real-time PCR实验结果显示舌鳞癌组织及舌鳞癌细胞系TCA8113细胞中的PTP4A1的mRNA表达水平高于其在癌旁和正常舌组织的表达,癌旁组织的表达高于正常舌组织的表达(P=0.000<0.05)。结论:PTP4A1基因mRNA水平和蛋白水平表达在舌鳞癌组织中表达均较癌旁和正常舌组织高,可能在舌鳞癌的发生发展过程中起着一定作用。

二斑叶螨乙酰辅酶A羧化酶基因全长cDNA克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆二斑叶螨(Tetranychus urticae)的乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)基因,对其进行生物信息学分析并研究其在二斑叶螨敏感和抗性品系中的表达量。【方法】利用RT-PCR技术克隆ACCase基因的cDNA全长,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性;利用实时荧光定量PCR方法分析ACCase基因在二斑叶螨敏感和抗螺螨酯品系中的表达差异。【结果】ACCase基因(GenBank登录号:JX424763)的开放阅读框长度为7 068 bp,编码2 235个氨基酸,分子量约为266.35 kD,理论等电点为6.38,包含典型的生物素羧化酶(biotin carboxylase,BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)和羧基转移酶(carboxyltransferase,CT)3个结构域。结合其它物种ACCase基因构建系统发育树表明,该基因与体虱(Pediculus humanus corporis)ACCase基因具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明,ACCase基因在抗螺螨酯品系中的相对表达量较高,与明感品系间存在显著差异。【结论】利用RT-PCR技术在二斑叶螨中克隆到ACCase基因,ACCase基因的过量表达可能与二斑叶螨对螺螨酯的抗性形成有关,为二斑叶螨的抗性治理提供了依据。

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16SrRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18TVector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。