【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-...【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。展开更多
采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在山东泰安4个鸡场舍内空气、舍外环境上风向10、50m和下风向10、50、100、200、400m不同距离处收集金黄色葡萄球菌，计算每个采样点的金黄色葡萄球菌浓度；与此同时，收集鸡的...采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在山东泰安4个鸡场舍内空气、舍外环境上风向10、50m和下风向10、50、100、200、400m不同距离处收集金黄色葡萄球菌，计算每个采样点的金黄色葡萄球菌浓度；与此同时，收集鸡的粪便，分离金黄色葡萄球菌。利用金黄色葡萄球菌DNA基因外重复一致回文序列聚合酶链式反应（Repetitive extragenic palindromic elements PCR，REP—PCR）鉴定技术，扩增不同测量点和粪便分离的金黄色葡萄球菌的DNA图谱。通过每个采样点的金黄色葡萄球菌的浓度变化以及金黄色葡萄球菌遗传相似性分析确认动物舍微生物气溶胶向舍外环境的传播。结果显示：4个鸡场舍内空气中金黄色葡萄球菌的浓度远远高于舍外上风和下风向的金黄色葡萄球菌浓度（P〈0．05或P〈0．01），但是舍外下风不同距离间的金黄色葡萄球菌浓度差异并不显著（P〉0．05）。REP-PCR结果表明，从鸡的粪便中分离的金黄色葡萄球菌与从舍内空气中分离的部分金黄色葡萄球菌（38．7％）相似性可达100％，从鸡场舍外下风方向分离到的多数金黄色葡萄球菌（55．9％）与舍内空气或粪便中分离的金黄色葡萄球菌相似性可达100％。可见，它们分别是由粪便中遗传基因完全相同的菌株繁殖而来。而从鸡舍上风分离到的金黄色葡萄球菌与舍内空气或粪便中分离的金黄色葡萄球菌相似性仅在60％～87％。结果显示，鸡粪便中的金黄色葡萄球菌能够形成气溶胶，进入气悬状态，不仅能在舍内传播，而且还能够借助舍内外气体交换，传播到舍外下风一定的距离。从而说明，来自动物体的金黄色葡萄球菌既能污染舍内空气，对本舍鸡群构成传染威胁，又能传播一定的距离，对周边社区环境空气造成生物污染。展开更多
文摘采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在山东泰安4个鸡场舍内空气、舍外环境上风向10、50m和下风向10、50、100、200、400m不同距离处收集金黄色葡萄球菌，计算每个采样点的金黄色葡萄球菌浓度；与此同时，收集鸡的粪便，分离金黄色葡萄球菌。利用金黄色葡萄球菌DNA基因外重复一致回文序列聚合酶链式反应（Repetitive extragenic palindromic elements PCR，REP—PCR）鉴定技术，扩增不同测量点和粪便分离的金黄色葡萄球菌的DNA图谱。通过每个采样点的金黄色葡萄球菌的浓度变化以及金黄色葡萄球菌遗传相似性分析确认动物舍微生物气溶胶向舍外环境的传播。结果显示：4个鸡场舍内空气中金黄色葡萄球菌的浓度远远高于舍外上风和下风向的金黄色葡萄球菌浓度（P〈0．05或P〈0．01），但是舍外下风不同距离间的金黄色葡萄球菌浓度差异并不显著（P〉0．05）。REP-PCR结果表明，从鸡的粪便中分离的金黄色葡萄球菌与从舍内空气中分离的部分金黄色葡萄球菌（38．7％）相似性可达100％，从鸡场舍外下风方向分离到的多数金黄色葡萄球菌（55．9％）与舍内空气或粪便中分离的金黄色葡萄球菌相似性可达100％。可见，它们分别是由粪便中遗传基因完全相同的菌株繁殖而来。而从鸡舍上风分离到的金黄色葡萄球菌与舍内空气或粪便中分离的金黄色葡萄球菌相似性仅在60％～87％。结果显示，鸡粪便中的金黄色葡萄球菌能够形成气溶胶，进入气悬状态，不仅能在舍内传播，而且还能够借助舍内外气体交换，传播到舍外下风一定的距离。从而说明，来自动物体的金黄色葡萄球菌既能污染舍内空气，对本舍鸡群构成传染威胁，又能传播一定的距离，对周边社区环境空气造成生物污染。
