苗药紫金牛、铁扫帚组方干预慢性阻塞性肺疾病大鼠气道Wnt通路RhoA基因与TGF-β_(1)、MMP-9的相关性研究

目的研究苗药紫金牛、铁扫帚组方干预COPD大鼠气道Wnt通路RhoA基因与TGF-β_(1)、MMP-9的相关性,从而探讨苗药紫金牛、铁扫帚配方干预COPD大鼠气道重塑的调控机制。方法构建COPD大鼠模型,进行气道成纤维细胞的培养,采用ELISA检测气道成纤维细胞上清液中TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子的含量,并运用Westernblot方法检测气道成纤维细胞中RhoA基因蛋白的表达,从而研究RhoA基因表达与TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子的相关性及苗药紫金牛、铁扫帚的影响。结果与正常组相比,COPD大鼠模型组气道成纤维细胞上清液中TGF-β_(1)、MMP-9的含量升高,同时RhoA基因在也是表达增高。经苗药紫金牛、铁扫帚治疗后,细胞因子TGF-β_(1)、MMP-9与RhoA基因的表达则降低,从而得出TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子与RhoA基因呈正相关。结论COPD大鼠气道成纤维细胞上清液中TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子是COPD大鼠气道重建中成纤维细胞增殖的关键因子。而RhoA基因对组织纤维化有关,且能调控细胞因子TGF-β_(1)、MMP-9。苗药紫金牛、铁扫帚能够抑制炎性因子TGF-β_(1)、MMP-9的表达及WNT通路的RhoA基因的增殖,从而寻求苗药紫金牛、铁扫帚配方干预COPD气道重塑的机制。

慢病毒和质粒作为shRNA载体沉默人卵巢癌RhoA基因效果的比较

目的研究慢病毒和质粒作为RNA干扰载体在沉默卵巢癌RAS同源基因家族成员A(RhoA)基因表达方面的差异。方法分别将慢病毒及质粒载体携带的针对RhoA基因的siRNA序列感染或转染卵巢癌HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选建立稳定沉默RhoA基因的细胞株。通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR、Western blot法、血管形成实验、细胞划痕实验研究两种载体随着细胞培养代数的增加在抑制卵巢癌RhoA基因表达及侵袭和转移能力上的差异。结果采用质粒载体及慢病毒载体分别建立人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过荧光显微镜观察,质粒组细胞绿色荧光蛋白的表达率随培养代数的增加而下降;第15代、第25代时表达率分别为70%、45%,而慢病毒组细胞绿色荧光蛋白表达率维持在95%以上,实时荧光定量PCR及Western blot法发现质粒组和慢病毒组细胞在第3代时RhoA mRNA及蛋白的表达无明显差异;随培养代数的增加,慢病毒组RhoA mRNA及蛋白持续低表达,而质粒组RhoA mRNA及蛋白的表达逐渐增高;细胞划痕实验及血管形成实验表明慢病毒较质粒作为载体介导siRNA对RhoA基因沉默更能持续稳定地抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移(P<0.05)。结论慢病毒较质粒作为载体介导RNA干扰能更好沉默目标基因的表达。

体外RNA干扰RhoA基因对舌癌细胞侵袭的影响

目的应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113和SCC-4中Rho A基因的表达,探讨Rho A基因表达下调对舌癌细胞侵袭的影响。方法登录Genbank数据库确定人Rho A基因序列,针对Rho A的基因序列设计短链RNA,利用Lipofectamine2000介导法将Rho A-si RNA转染至舌癌Tca8113和SCC-4细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后的舌癌细胞中Rho A m RNA的表达,蛋白质印迹法检测Rho A、半乳糖凝集素-3(galectin-3)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果舌癌细胞转染Rho A-si RNA后,Rho A的基因和蛋白表达下降,galectin-3和MMP-9蛋白表达下降,细胞体外侵袭能力降低。结论 Rho A-si RNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4细胞中Rho A的表达,通过降低galectin-3和MMP-9的表达从而降低细胞的侵袭能力。Rho A在舌癌的侵袭和转移中可能发挥重要的作用。

抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌(BC)细胞凋亡的作用。方法通过已建立的RhoA腺病毒载体系统,感染BC MCF-7细胞。经过细胞培养、病毒滴度等,将收集的样本分别用Western blot、RT-PCR技术检测RhoA蛋白表达和基因表达变化;对感染Adsi RNA-RhoA的BC细胞进行MTT检测及细胞内DNA片段化检测。结果腺病毒siRNA-RhoA感染BC细胞能明显抑制RhoA基因表达(抑制率为75.64%),降低RhoA基因的mRNA转录水平69.44%。MTT检测结果表明,感染腺病毒Adsi RNA-RhoA组的肿瘤细胞生长、增殖被明显抑制。TUNEL检测显示,抑制RhoA基因表达能明显导致BC细胞凋亡。结论利用siRNA抑制BC细胞中RhoA基因表达,能诱导BC细胞凋亡。

慢病毒介导RhoA基因沉默对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响

目的:建立慢病毒介导RhoA基因稳定沉默卵巢癌HO8910细胞株,研究RhoA基因对HO8910细胞侵袭和迁移的影响。方法:构建靶向沉默RhoA基因的慢病毒载体Lenti-U6-shRhoA,将其感染HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选,建立稳定沉默RhoA基因的HO8910细胞。实时荧光定量PCR检测HO8910细胞中RhoA mRNA的表达;MTT检测HO8910细胞的增殖;Transwell体外迁移和侵袭实验检测RhoA基因沉默对HO8910细胞侵袭和迁移的影响。结果:成功构建靶向RhoA基因的慢病毒载体Lenti-U6-shRhoA,建立了RhoA基因稳定沉默的HO8910细胞。与Lenti-U6-NC对照组对比,RhoA基因稳定沉默HO8910细胞RhoA mRNA的表达明显降低[(30.7±5.40)%vs(95.9±6.53)%,P<0.05];沉默RhoA基因能降低HO8910细胞的存活率[(51.16±7.41)%vs(95.67±2.14)%,P<0.05];RhoA基因沉默组HO8910细胞的侵袭、迁移及黏附能力较Lenti-U6-NC对照组明显受到抑制[迁移穿过人工基底膜细胞数(31±6)vs(84±13)个,P<0.05;穿过微孔膜的细胞数(97±12)vs(689±23)个,P<0.05;黏附率(68.16±6.53)%vs(98.71±4.92)%,P<0.05]。结论:慢病毒介导的RhoA基因沉默能抑制卵巢癌HO8910细胞的侵袭和迁移。

白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建及RhoA基因表达的影响

目的:探讨白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建及其对于RhoA基因表达的影响。方法:60只Wistar大鼠分为六组,A组(正常对照组)、B组(阴性对照组)、C组(哮喘模型组)、D组(地塞米松组)、E组(白芥子散2 h组)以及F组(白芥子散4 h组),每组10只。造模成功后,A组、B组和C组正常饲养;D组腹腔注射地塞米松;E和F组背部剃毛,并在其双侧肺俞、脾俞、肾俞采用白芥子散分别艾灸2 h和4 h。检测和比较六组大鼠支气管肺泡灌洗液中的总细胞数、中性粒细胞数以及巨噬细胞数,白细胞介素-6和TNF-α的表达水平,以及肺组织中RhoA基因的蛋白质表达水平。结果:肺泡组织HE染色结构显示,采用地塞米松和白芥子散治疗2 h和4 h后肺泡结构的破坏,炎性细胞的浸润明显减轻。与正常对照组相比较,哮喘模型组支气管肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量均显著增加(均P<0.05),TNF-α和IL-6水平均显著增加(均P<0.05),肺组织中的RhoA基因的蛋白质表达水平显著增加。地塞米松和白芥子散2 h和4 h治疗显著减少了支气管肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量(均P<0.05),TNF-α和IL-6水平均显著增加(均P<0.05),减少了肺组织中的RhoA基因的蛋白质表达水平。结论:白芥子散可改善抗原诱导的大鼠哮喘,助其免疫稳态的重建,其作用机制可能是通过减少RhoA基因的蛋白质表达水平而实现的。

天灸药物白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建及其对于RhoA基因表达的影响

目的本研究旨在探讨天灸药物白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建及其对于RhoA基因表达的影响。方法60只Wistar大鼠分为6组,A组(正常对照组)、B组(阴性对照组)、C组(哮喘模型组)、D组(地塞米松组)、E组(白芥子散2 h组)以及F组(白芥子散4 h组),每组10只。造模成功后,A组、B组和C组正常饲养;D组腹腔注射地塞米松;E和F组背部剃毛,并在其双侧肺俞、脾俞、肾俞采用白芥子散分别艾灸2 h和4 h。检测和比较6组大鼠支气管肺泡灌洗液中的总细胞数、中性粒细胞数以及巨噬细胞数,白细胞介素-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平,以及肺组织中RhoA基因的蛋白质表达水平。结果肺组织苏木素-伊红(HE)染色结构显示,采用地塞米松和白芥子散治疗2 h和4 h后肺泡结构的破坏,炎性细胞的侵润明显减轻。与A组相比较,C组支气管肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量均显著增加(均P<0.01),TNF-α和IL-6水平均显著增加(均P<0.01),肺组织中的RhoA基因的蛋白质表达水平显著增加。地塞米松和白芥子散2 h和4 h治疗显著减少了支气管肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量(均P<0.01),TNF-α和IL-6水平均显著增加(均P<0.01),以及肺组织中的RhoA基因的蛋白质表达水平。结论天灸药物白芥子散可改善抗原诱导的大鼠哮喘,帮助其免疫稳态的重建,其作用机制可能通过是减少RhoA基因的蛋白质表达水平而实现的。

腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用。方法用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平。感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测。结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统。用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48%;RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46%。MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P>0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显。TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著。结论构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础。

RhoA、C干扰载体的构建及其对直肠癌HCT116细胞相应基因表达的影响

目的构建RhoA和RhoC干扰载体,观察其对结直肠癌细胞内RhoA和RhoC基因表达的抑制作用。方法设计合成针对人RhoA和RhoC基因序列的各4对含有小发夹结构的寡核苷酸序列,将其连入pGensil-1质粒中,构建特异性shRNA表达载体并转染结直肠癌细胞HCT116。应用荧光定量PCR法检测HCT116细胞中的RhoA和RhoC mRNA。结果成功构建了特异性shRNA表达载体,将其转染HCT116细胞后,细胞内RhoA和RhoC mRNA的表达水平与未转染组相比,P<0.05。结论构建的RhoA和RhoCshRNA干扰载体能有效抑制HCT116细胞的RhoA mRNA和RhoC mRNA表达。

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

为深入研究Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,Rhoa)和环氧合酶2(cyclooxygenase 2,Ptgs2)分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列(登录号:JN971019.1和NM_011198)设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用LipofectamineTM2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。

短发夹状RNA抑制RhoA基因在HepG2细胞中的表达

目的构建针对人RhoA基因的短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对人肝癌细胞株HepG2 RhoA表达的特异性抑制效应。方法设计合成针对RhoA mRNA编码序列两个不同靶点的核苷酸片断,并定向克隆到真核表达载体Pgenesil-2的U6启动子下,构建重组质粒phsRNA-RhoA1和pshRNA-RhoA2,不针对任何基因组序列的重组质粒pshRNA-HK作为阴性对照。脂质体法转染到HepG2细胞后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)分别检测RhoA基因表达的抑制效应。结果酶切鉴定和测序结果证实重组质粒均构建成功。转染HepG2后,pshRNA-RhoA2组RhoA基因mRNA和蛋白的表达水平均显著降低,与pshRNA-HK组和空白细胞组相比,差异有统计学意义(r=-19.28,t=-7.08,P<0.05)。而pshRNA-RhoA1组抑制效应不明显,差异无统计学意义(r=-0.16,t=-0.30,P>0.05)。结论构建的重组质粒pshRNA-RhoA2能特异有效地抑制RhoA基因在肝癌细胞HepG2中的表达,为进一步研究RhoA基因在肝癌中的作用提供了有效的分子工具。

RhoA与卵巢癌的研究进展

卵巢癌是女性常见的三大恶性肿瘤之一，近年来卵巢癌发病率逐年上升，但由于卵巢深藏于盆腔，其发病隐蔽，至今缺乏有效的早期诊断方法，大部分患者就诊时多为晚期，治疗及预后差，5年生存率长期徘徊在15％～30％之间。如将目前早期卵巢癌的诊断率由25％提高至75％，则可减少癌死亡人数的50％，因此研究早期卵巢癌的诊断指标，尤其是敏感指标以及基因对卵巢癌的治疗显得尤为重要。

RhoA在食管癌中的表达及其机制研究

目的:研究RhoA基因在人食管癌中的mRNA表达及其与肿瘤发生的关系。方法:采用SYBR Green实时定量PCR技术检测30例食管癌组织及癌旁组织中的RhoA基因的mRNA水平。同时,采用免疫组化技术检测上述30例组织中RhoA的蛋白水平及分布。结果:与癌旁组织相比,RhoA基因在食管癌组织中mRNA水平较癌旁组织显著上调,癌旁组织中RhoA的表达为0.39±0.09,食管癌组织中RhoA的表达为0.94±0.25,与癌旁组织相比小上调2.4倍。免疫组化的结果也表明,RhoA基因在食管癌组织中表达要高于癌旁组织,并且主要分布于细胞浆。结论:RhoA基因在人食管癌中较癌旁组织表达显著上调,RhoA基因的表达与食管癌的发生密切相关。

右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

目的探讨右美托咪定(DEX)对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法建立VILI大鼠模型,将大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)。测定大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D);HE染色观察肺组织病理形态;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平;TUNEL染色法检测肺上皮细胞死亡;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及RhoA、ROCK1表达水平。结果DEX可以减轻VILI大鼠肺损伤,降低肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达(P<0.05),升高Bcl-2表达(P<0.05);LPA可以促使大鼠肺损伤加重,肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过抑制RhoA/ROCK1通路保护大鼠呼吸机相关性肺损伤。

蒙成药额日敦-乌日勒水提取物对OGD诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护作用

目的蒙成药额日敦-乌日勒水提取物对氧糖剥夺(OGD)诱导人神经母细胞瘤系(SH-SY5Y)细胞氧化损伤的保护作用。方法建立OGD诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型。利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测每组细胞的存活率,确定最佳药物浓度及给药时间。确定最佳药物浓度及给药时间后,利用乳酸脱氢酶(LDH)检测最佳药物浓度和给药时间后各组细胞的损伤抑制率,利用Real-Time PCR和Western印迹法检测每组细胞的神经轴突生长抑制因子受体(NgR)1、Ras同源基因家族成员(Rho)A mRNA和蛋白的表达变化。结果与OGD模型组相比,额日敦-乌日勒10μg/ml组24、48 h和15μg/ml组12、24、48 h的细胞存活率明显提高(P<0.01)。LDH检测结果:与对照组相比,OGD模型组LDH释放显著增高(P<0.01);与OGD模型组相比,实验组LDH释放显著降低(P<0.01)。与对照组相比,OGD模型组和实验组细胞NgR1和RhoA mRNA及蛋白表达均显著增加(P<0.01);与模型组相比,实验组细胞NgR1和RhoA mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.01)。结论蒙成药额日敦-乌日勒对OGD诱导SH-SY5YS细胞氧化损伤具有保护作用,其机制可能是通过抑制细胞内氧化应激,下调抗凋亡蛋白NgR1、RhoA的高表达,从而减少神经细胞凋亡。

香砂六君子汤调控RhoA/ROCK2/MYPT1信号通路改善功能性消化不良大鼠胃动力的机制

目的:基于RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)/肌球蛋白轻链磷酸酶靶向亚基1(MYPT1)信号通路探讨香砂六君子汤对功能性消化不良(FD)大鼠胃动力障碍的干预机制。方法:将60只SPF级雄性SD乳鼠随机分为正常组(n=10)和造模组(n=50),造模组大鼠采用综合造模法复制FD大鼠模型。模型复制成功后将造模组大鼠随机分为模型组、莫沙必利组和香砂六君子汤高、中、低剂量组,共5组,每组10只。正常组和模型组大鼠给予10 mL·kg^(-1)·d^(-1)生理盐水灌胃,莫沙必利组给予1.35 mg·kg^(-1)·d^(-1)莫沙必利灌胃,香砂六君子汤高、中、低剂量组分别给予12、6、3 g·kg^(-1)·d^(-1)香砂六君子汤汤剂灌胃,持续干预14 d。造模和给药前后观察大鼠一般生存状况,测定大鼠体质量、3 h平均进食量。给药干预结束后,测定大鼠肠推进率,采用苏木素-伊红(HE)染色观察胃组织病理改变,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组大鼠延髓和胃组织匀浆液中胆碱乙酰转移酶(ChAT)、血管活性肠肽(VIP)含量,采用冰冻切片染色技术观察各组大鼠胃窦平滑肌中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)酶分布,采用蛋白免疫印迹法检测胃组织中RhoA、ROCK2、磷酸化(p)-MYPT1蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠毛发枯乱、倦懒怠动、行动缓迟,一般生存状况较差,体质量、3 h平均进食量以及肠推进率均明显下降(P<0.05);胃组织病理未见明显异常;延髓和胃组织中ChAT含量减少,胃组织中VIP含量增多,胃窦平滑肌中ATP酶分布明显减少,胃组织中RhoA、ROCK2、p-MYPT1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与模型组比较,各给药组大鼠一般生存状况明显好转,体质量、3 h平均进食量及肠推进率明显增加(P<0.05);胃组织病理未见明显差异;延髓和胃组织中ChAT含量明显增加,胃组织中VIP含量减少,胃窦平滑肌中ATP酶分布明显增加,胃组织中RhoA、ROCK2、p-MYPT1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),上述指标香砂六君子汤组干预作用呈剂量依赖性。结论:香砂六君子汤能够有效改善FD大鼠一般生存状况及胃动力,其具体机制可能与香砂六君子汤激活胃组织中RhoA/ROCK2/MYPT1信号通路调控平滑肌舒缩,促进胃动力有关。

RhoA蛋白对结核杆菌侵袭A549细胞的影响

探讨结核杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)侵袭A549细胞过程中RhoA蛋白功能。构建靶向RhoA基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体si-RhoA,转染A549细胞,36 h后进行MTB黏附和侵袭细胞实验,蛋白印迹法(Western blot)检测RhoA蛋白表达水平,电镜观察细胞超微结构改变,激光共聚焦显微镜观察细胞微丝骨架变化并计算F-actin重排指数,定量PCR法测量细胞黏附和内吞的MTB数量。结果显示,si-RhoA转染A549细胞后,RhoA蛋白表达下降84.7%,细胞对MTB的黏附能力未改变。MTB侵袭细胞实验显示,si-RhoA转染组细胞F-actin重排指数和内吞细菌数量分别是(63.0±3.1)%和(3.19±0.26)×103拷贝,无关siRNA组分别是(84.5±1.8)%和(4.45±0.29)×103拷贝,前者均少于后者(P<0.01)。由此可见,结核杆菌侵袭A549细胞需要RhoA蛋白参与,可能通过"拉链"机制介导结核杆菌侵袭非吞噬细胞。

淫羊藿苷通过调节RhoA/ROCK信号通路改善AD神经元和树突损伤的机制

目的:观察淫羊藿苷对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路的作用,并探讨其改善神经元和树突损伤的作用机制。方法:通过对大鼠双侧侧脑室注射β样淀粉蛋白1-42(Aβ_(1-42),2.5 g·L^(-1))建立AD模型,并将大鼠分为模型组,淫羊藿苷低、中、高剂量组(0.03、0.06、0.09 g·kg^(-1)),另设空白组。空白组和模型组按10 mL·kg^(-1)的剂量灌胃等体积的生理盐水。采用Morris水迷宫评估大鼠的认知功能。采用尼氏染色观察大鼠海马CA1区病理形态。采用高尔基染色观察大鼠海马CA1区树突棘密度和树突长度。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠海马中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、RhoA、ROCK1和ROCK2的m RNA表达水平。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-6、RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠逃避潜伏期显著增加(P<0.01),穿越平台次数和目标象限驻留时间显著减少(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷中、高剂量组大鼠逃避潜伏期减少(P<0.05,P<0.01),穿越平台次数和目标象限驻留时间增加(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区神经元数量、树突棘密度和树突长度显著减少(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷中、高剂量组大鼠海马CA1区神经元数量、树突棘密度和树突长度增加(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-6、Rho A、ROCK1、ROCK2的m RNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷中、高剂量组大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-6、Rho A、ROCK1、ROCK2的m RNA和蛋白表达水平下降(P<0.05,P<0.01)。结论:淫羊藿苷改善AD认知功能、神经元和树突损伤可能与抑制Rho A/ROCK信号通路相关。

黄芩苷对大鼠膝关节骨性关节炎的炎症调节作用研究

目的研究黄芩苷治疗大鼠膝骨关节炎的作用机制。方法将60只大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组(用弗氏完全佐剂构建模型)、低剂量实验组(20 mg·kg^(-1)黄芩苷)、高剂量实验组(40 mg·kg^(-1)黄芩苷)和阳性对照组(5 mg·kg^(-1)Rho激酶抑制药Y-27632),每组10只,连续治疗4周。检测大鼠关节肿胀度,并评估Lequesne MG评分;收集关节液和软骨组织,用苏木精-伊红染色法观察大鼠软骨组织病理变化,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测关节液中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)表达水平,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验检测软骨组织中Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关蛋白激酶1(ROCK1)、Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)mRNA表达水平,用蛋白质印迹法检测软骨组织中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平。结果空白对照组、假手术组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和阳性对照组大鼠治疗4周后膝关节直径分别为(9.88±0.34)、(9.96±0.31)、(13.54±0.70)、(13.35±0.54)、(11.89±0.37)和(11.67±0.41)mm,IL-6水平分别为(19.82±1.78)、(20.69±1.84)、(83.26±4.45)、(83.62±4.71)、(42.30±2.98)和(38.44±2.53)pg·mL^(-1),TNF-β水平分别为(8.86±1.41)、(9.45±1.37)、(33.71±2.63)、(34.14±2.83)、(23.71±1.93)和(20.85±1.69)pg·mL^(-1),RhoA mRNA表达水平分别为1.00±0.13、1.04±0.11、1.69±0.26、1.64±0.20、1.24±0.18和1.14±0.17,ROCK1 mRNA表达水平分别为1.00±0.15、1.02±0.12、1.48±0.19、1.53±0.21、1.21±0.17和1.16±0.18,ROCK2 mRNA表达水平分别为1.00±0.14、1.06±0.11、1.41±0.20、1.43±0.18、1.18±0.17和1.15±0.16。模型组与假手术组比较,高剂量实验组与模型组或低剂量实验组比较,阳性对照组与模型组或低剂量实验组比较,上述指标在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论黄芩苷可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路减轻膝骨关节炎大鼠炎性反应。

基于RhoA/ROCK信号通路探讨逍遥散对肝郁脾虚证大鼠胃肠动力的影响

目的:通过观察逍遥散对肝郁脾虚证大鼠胃组织RAS同源基因家族成员A(RhoA)和Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)1、ROCK2表达的影响,探讨其调节肝郁脾虚证大鼠胃肠动力的作用机制。方法:72只SD雄性大鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、氟西汀组(0.0018 g·kg^(-1))、逍遥散高(16.7 g·kg^(-1))、中(8.35 g·kg^(-1))、低(4.175 g·kg^(-1))剂量组,每组12只。除正常组外,其余各组大鼠采用慢性束缚应激方法造模,造模同时正常组和模型组大鼠给予10 mL·kg^(-1)生理盐水灌胃,各药物组大鼠给予相应剂量的药物灌胃,每日1次,共21 d。造模结束后,测定各组大鼠胃排空率、小肠推进率;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胃组织RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠胃排空率、小肠推进率及胃组织RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,逍遥散高、中、低剂量组明显升高大鼠胃排空率、小肠推进率及胃组织RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:逍遥散对肝郁脾虚证大鼠胃肠动力的改善可能与上调胃组织RhoA/ROCK信号通路的活性有关。