链霉素耐药结核分支杆菌rpsL基因分析

结核分支杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis.TB)的rpsL基因突变往往与链霉素 (Streptomycin .SM)耐药变异有关。选择了 77例TB临床分离株 ,应用BACTEC4 6 0快速培养系统进行常规药敏实验 ,同时针对rpsL基因进行聚合酶链反应 (PCR) ,对PCR产物进行单链构型多态性 (SSCP)分析 ,MboⅡ酶切后的限制性片段长度分析 (RFLP)和序列测定分析。常规药敏实验显示 :有 2 0株为SM敏感 ,5 7株为耐药。SSCP显示 :34株的rpsL基因为野生型 ,4 3株为突变型。与常规药敏相比SSCP的特异性和阳性预期值分别为 95 %和 98%。RFLP显示 :81 4 %的突变类型使其失去MboⅡ酶切位点。序列测定显示 :失去MboⅡ酶切位点的突变为rpsL基因 4 3位密码子存有单碱基突变 (AAG→AGG)。实验结果表明 ,TB对SM耐药变异与rpsL基因突变相关 ,其中第 4 3位密码子的突变是最常见的原因。

耐链霉素结核分枝杆菌rpsL基因高突变位点43Codon分子信标检测的实验研究

目的选择耐链霉素(STR)结核分枝杆菌rpsL基因主要突变位点密码子43序列设计分子信标探针及扩增体系,并建立运用荧光显微镜及图像分析软件检测荧光结果及定性判断的方法。方法运用软件Beacon designer设计43Codon分子信标探针及建立其扩增体系,采用荧光显微镜观测反应后的荧光信号及图像分析软件定性判断结果。结果包含43Codon rpsL基因聚合酶链反应(PCR)扩增产物条带清晰;通过荧光显微镜观测到标准株及耐STR株PCR产物与分子信标探针杂交后荧光信号区别明显;67株耐STR与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,P<0.05和P<0.01的耐STR组检出率为80%。结论分子信标技术是一种具有高灵敏、高特异核酸检测技术;采用荧光显微镜观测荧光信号具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点。

应用PCR-RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 了解结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。方法 通过PCR-RFLP分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因突变的部位和性质。结果 以H37RV标准株为对照,13株敏感株的rpsL基因有MboⅡ酶切位点;37株耐SM分离株中,31株(838%)无MboⅡ酶切位点;12株耐其它抗结核药物株中,也有2株无MboⅡ酶切位点。结论 大多数结核分枝杆菌SM耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)第43位密码子有点突变。PCR-RFLP可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法。

临床分离结核分枝杆菌耐药性质与rpoB、rpsL基因变异的研究

目的:对从疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌的rpoB和rpsL基因突变情况进行研究,分别探讨其与耐利福平(RFP)和耐链霉素(SM)之间的关系。方法:采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株和1株卡介苗株(BCG)的rpoB和rpsL基因进行序列分析。结果:分离得到耐利福平27株,耐链霉素25株,经测序分析,所有利福平、链霉素敏感株rpoB、rpsL基因均未发生氨基酸突变;RFP和SM耐药株rpoB和rpsL基因的突变率各为81.5%(22/27)和76%(19/25);耐利福平以Ser531Leu突变最为常见,突变频率为55.6%(15/27),耐链霉素以Lys43Arg位突变最为常见,突变频率为72.0%(18/25)。结论:rpoB和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌RFP和SM耐药性。

结核分支杆菌rpsL基因突变的快速检测

目的 建立快速检测结核分支杆菌rpsL基因突变的方法。方法 用聚合酶链反应(PCR)直接从结核分支杆菌基因组扩增rpsL基因,并直接进行测序鉴定。结果 用引物P1,P2 扩增H3 7RvDNA获得约4 6 0bp片段,经序列测定后,显示与GeneBank中公布的序列一致(同源性99% )。2 8株结核分支杆菌耐SM分离株中,2 0株rpsL基因突变位于4 3位密码子,另8株分离株未出现rpsL基因突变。结论 rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,本研究为进一步研究链霉素作用方式和耐药机制提供了有力手段。

荧光显微观测Rpsl基因突变DNA分子探针杂交研究

目的选择结核杆菌耐链霉素(Sm)Rpsl基因包含88codon突变位点的序列设计分子信标,建立扩增体系及分子信标芯片检测方法。方法运用软件:Beacon designer设计Rpsl基因包含88codon突变位点的分子信标及及其单侧延长臂分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法,应用荧光显微镜观测荧光信号。结果通过荧光显微镜观测到标准株及耐SM株PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;51株耐链霉素(SM)与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,P(0.05和P(0.01的耐SM组Rpsl基因88codon突变检出率为61%。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术。单侧延长臂分子信标对解决分子信标在芯片表面固定难题提供了一种有效方法,采用荧光显微镜观测荧光信号具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点。

武汉地区结核分枝杆菌链霉素耐药分离株rpsL基因分子特征研究

探讨武汉地区结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药临床分离株rpsL基因分子特征。收集71株临床分离株,采用刃天青法测定临床分离株对SM的最低抑菌浓度(MIC),同时用直接测序法分析rpsL基因的突变情况;用RD105基因缺失检测法鉴定71株临床分离株中"北京基因型"菌株。结果显示20株SM敏感株rpsL基因未发现突变(MICs<0.25 mg/L);51株SM耐药株中,35株(68.6%)检测到rpsL基因突变,主要发生在第43位和88位密码子,MIC1 mg/L的SM耐药株(低水平耐药株)总突变率低于MIC2mg/L(高水平耐药株);北京基因型与耐药株的相关性不大。研究表明SM耐药菌株rpsL基因突变类型存在地域差异;rpsL突变与SM高水平耐药的相关性在本研究中关联度不大;"北京基因型"菌株在武汉地区呈流行趋势。

应用PCR-直接测序法测定结核分支杆菌rpsL基因突变的研究

目的：了解我国结核分支杆菌耐链霉素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ＳＭ）分离株ｒｐｓＬ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）－单链构象多态性（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＤｉｒｅｃｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＤＳ）分析３８株结核分支杆菌耐ＳＭ分离株的ｒｐｓＬ基因。结果３８株耐ＳＭ分离株中，２５株ＳＳＣＰ异常、不被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析４３位密码子ＡＡＧ→ＡＧＧ突变；１株ＳＳＣＰ异常、可被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析３３位密码子ＧＴＡ→ＡＴＡ突变；１２株ＳＳＣＰ正常、可被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析未见异常；未发现８８位密码子突变。结论：大多数结核分支杆菌耐ＳＭ是由于其ｒｐｓＬ基因４３位密码子突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定部分结核分支杆菌ＳＭ耐药基因型。

甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌耐链霉素rpsL基因突变位点的检测

目的 通过检测甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌耐链霉素rpsL基因位点,掌握该地区鼠疫菌对链霉素的敏感性,以期为今后该地区鼠疫的治疗及临床用药提供参考依据。方法 根据鼠疫菌rpsL基因序列及我国发现的耐链霉素菌株(S19960127)突变位点分别设计非突变菌株FAM(128∶A)和突变菌株VIC(128∶G)两种MGB探针,通过TaqMan-MGB探针法对1962—1991年分离自甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地的49株代表性鼠疫菌进行耐链霉素rpsL基因突变位点检测。结果 被试菌株对应检测rpsL(128∶A),49株FAM染料RFU峰值均为阳性,其RFU峰值>2 000,阴性<200;对应检测rpsL(128∶G)未检测到VIC染料RFU峰值阳性菌株,RFU峰值均<200,阳性对照>1 000,该疫源地分离的鼠疫菌未发现耐链霉素菌株。结论 甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地49株鼠疫菌对链霉素均敏感。TaqMan-MGB探针荧光定量PCR体系具有较高灵敏性、特异性,可应用于鼠疫菌耐药性监测。

用rpsL基因突变实验评价丙烯酰胺致突变性的方法初探

采用rpsL基因突变实验对丙烯酰胺的致突变性进行了初步研究。实验设0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL 5个丙烯酰胺的剂量组和阴性、阳性对照组。结果发现,丙烯酰胺剂量组的突变频率与阴性对照组相比均有显著差异,并且有剂量效应关系,表明丙烯酰胺可诱发rpsL位点的突变。由于rpsL突变实验自发突变背景水平低、灵敏度高,因此rpsL突变实验有望成为食品和医药领域中致癌物快速检测的有效工具。

耐链霉素结核分枝杆菌rpsL基因突变的研究

结核分枝杆菌的耐药性问题人们长期关注的焦点问题。对耐药性机制的研究将加深药物与结核杆菌相互作用机理的认识，有助于开发新药，发展简便、快速的检测方法，为结核病的化疗方案、病情监测及耐药性流行病学调查提供帮助。然而，常规耐药性测定需时太久，不能满足临床需要，因此探索新的快速、灵敏的耐药性测定方法迫在眉急。近来报导聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)用于耐SM基因(rpsL)突变的检测具有较多的优越性，为此我们也在这方面进行了探索。现将结果报道如下。

多耐药临床分离株结核杆菌rpsL基因重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL的构建及其功能鉴定

目的:构建多耐药临床分离株结核杆菌rpsL基因重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL及其功能鉴定。方法:制备临床分离株多耐药结核杆菌基因组DNA,PCR扩增该株结核杆菌rpsL基因,构建及鉴定该株结核杆菌rpsL基因重组穿梭质粒PMV261/rpsL,重组穿梭质粒PMV261/rpsL电转化结核杆菌H37Rv株及其鉴定。结果:成功地构建了重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒PMV261/rpsL;重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒PMV261/rpsL电转化结核杆菌H37Rv株获得成功,并且重组质粒PMV261/rpsL电转化后的结核杆菌H37Rv株对链霉素耐药。结论:该临床分离株多耐药结核分支杆菌对链霉素耐药的机制仅仅是由于rpsL基因的93bp、94bp处碱基突变所致,耐药性是一个基因突变的结果,是单基因型。

基于TaqMan-MGB荧光探针的实时荧光PCR法检测玉树藏族自治州鼠疫耶尔森菌rpsL基因耐药突变

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种烈性传染病,发病急、传播快且病死率极高。历史上发生过3次鼠疫大流行,导致上亿人口死亡。近20年来全球鼠疫疫情呈上升趋势,2000-2018年,世界卫生组织(WHO)共收到来自美洲、非洲和亚洲21个国家报告的2万多起鼠疫病例[1]。我国动物间鼠疫一直较为活跃,且除个别年份外,几乎每年都有人间鼠疫发生。2019年11月,北京市首先出现2例内蒙古自治区输入性肺鼠疫病例,随后内蒙古自治区又报道2例腺鼠疫病例,提示这一甲类传染病仍对人们的生命安全具有极大的潜在威胁[2,3,4]。链霉素是WHO鼠疫手册[5]和我国《鼠疫诊疗方案(试行)》(卫办应急发[2011]第18号)[6]中治疗鼠疫的首选药物。但值得注意的是,2021年Dai等[7]发现国内1株鼠疫菌因编码核糖体蛋白S12的rpsL基因第128 bp位点的碱基发生了突变,从而产生了对链霉素的高度耐药性。为此,本研究应用基于TaqMan-MGB荧光探针的实时荧光PCR法(简称MGB荧光探针法),选取鼠疫流行较为严重的玉树藏族自治州(以下简称玉树州)鼠疫自然疫源地内分离的鼠疫菌,检测链霉素耐药位点rpsL基因第128 bp位点碱基的突变情况,判断当地菌株的耐药情况,为鼠疫疫情的防控提供参考。

甘肃省鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌耐链霉素基因rpsL突变位点的检测

目的分析甘肃省鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)耐链霉素基因rpsL序列突变特征,为突发人间鼠疫病临床用药及鼠疫菌耐药监测提供依据。方法选取1962—2022年分离自甘肃省不同类型鼠疫疫源地376株鼠疫菌,提取DNA,根据鼠疫菌耐链霉素基因rpsL设计PCR引物和TaqMan-MGB荧光探针,采用PCR产物直接测序法分析rpsL基因的突变位点,实时荧光PCR技术对甘肃省不同疫源地鼠疫菌耐链霉素基因rpsL的128位点碱基突变进行检测。结果376条rpsL基因序列比对分析发现甘肃省不同类型鼠疫疫源地鼠疫菌rpsL基因全序列均未发生变异,不同年代的鼠疫菌rpsL基因碱基序列均相同,证实甘肃省鼠疫菌rpsL基因序列保守。376株甘肃省不同鼠疫疫源地鼠疫菌羧基荧光素(FAM)探针检测结果均为阳性,对应检测rpsL基因(128:A),ΔRn(normalized reporter)>3000000;所有鼠疫菌株亚磷酰胺(VIC)探针检测结果均为阴性,对应检测rpsL基因(128:G),ΔRn<100000。结论建议甘肃省喜马拉雅旱獭疫源地动物鼠疫持续流行的鼠疫监测点实验室进行鼠疫菌耐药性监测,及时发现本地鼠疫菌rpsL基因特征,为突发人间鼠疫诊疗提供依据。

武汉地区结核分枝杆菌氨基糖苷类抗生素耐药分离株rpsL和rrs基因特征分析

目的阐明武汉地区结核分枝杆菌分离株氨基糖苷类药物耐药相关基因rpsL和rrs的分子突变特征。方法从武汉医疗救治中心共收集69株结核分枝杆菌的临床菌株,包括耐链霉素(SM)菌株35株(其中4株同时对卡那霉素耐药)和SM敏感菌株34株(其中全敏感20株)。采用PCR直接测序法分析rpsL和rrs基因的分子突变特征。结果 35株SM耐药株中有26株(74.3%)检测到rpsL突变,突变位点集中在第43位和第88位密码子,并发现了1个新的突变类型Lys88Glu;13株耐药株(37.1%)检测到四种不同类型的rrs基因突变,分别为A1401G(17.1%,6/35)、A514C(14.3%,5/35)、G1487A(2.9%,1/35)和C517T(2.9%,1/35),1株全敏感菌株的rrs基因发生了C1029T突变。卡那霉素耐药株中只有3株检测到了rrs突变,并发现了一种rrs基因尚未见报道的G1487A突变类型。结论结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物的耐药与rpsL和rrs突变相关,耐药基因突变类型存在地域差异。

结核分枝杆菌链霉素耐药分离株rpsL基因突变的检测

目的 探讨结核分枝杆菌 (结核菌 )对链霉素 (Sm)产生耐药性的分子机制 ,建立直接快速检测结核菌Sm药物敏感性的试验方法。方法 应用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)银染分析技术检测 32株结核菌临床分离株的rpsL基因。结果 以结核菌标准株 (H37Rv)为对照 ,32株结核菌临床分离株中 ,10株Sm敏感株的rpsL基因未见SSCP泳动异常 ,2 2株Sm耐药株中 ,16株(72 .7% )的rpsL基因出现SSCP泳动异常。结论 rpsL基因突变是结核菌对链霉素产生耐药性的重要分子机制 ,PCR SSCP银染技术可能成为快速检测结核菌Sm药物敏感性的新方法。

耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因特征分析

目的阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌rps L基因突变特征,为本地区耐多药结核病的有效预防控制提供科学依据。方法从宁波市疾病预防控制中心共收集67例耐多药结核分枝杆菌临床分离株,包括耐链霉素（SM）菌株40株和SM敏感菌株27株。采用PCR直接测序法分析rps L基因的分子突变特征。结果 40株耐SM菌株中有31株rps L发生突变,突变率为77.50%,突变类型主要为Lys43Arg和Lys88Arg;27株SM敏感菌株中有4株发生突变,突变率为14.81%,突变类型主要为Ala119Gly。耐多药结核分枝杆菌中SM耐药株rps L基因突变率明显高于SM敏感株,两者之间差异有统计学意义（χ^2=25.387,P〈0.05）。结论宁波地区耐多药结核分枝杆菌rps L基因突变与链霉素耐药高度相关,其中Lys43Arg突变是主要突变类型,耐药基因突变类型存在地区差异。

应用TaqMan-MGB探针RT-qPCR技术对青海省海南州鼠疫菌耐链霉素rpsL基因突变位点的检测

目的研究青海省海南藏族自治州(海南州)鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)对链霉素的敏感性,以便在突发鼠疫疫情中能精准地指导鼠疫临床用药。方法根据鼠疫菌基因序列设计特异性引物,以S19960127菌株核糖体蛋白S12编码基因(rpsL基因)突变位点和野生型鼠疫菌株rpsL基因位点分别设计探针,利用TaqMan-MGB探针技术对海南州1954-2009年分离的87株鼠疫菌进行耐链霉素rpsL基因突变位点检测。结果87株被试菌株的野生型A碱基的羧基荧光素(FAM)探针检测结果均为阳性,每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Ct)值在18.74~21.93,相对荧光单位(RFU)峰值>2000;S19960127的Ct值为25.42,RFU峰值<200;阴性对照RFU峰值<200。所有被试菌株突变型G碱基的亚磷酰胺(VIC)探针检测结果均为阴性,Ct值在20.04~24.79,RFU峰值<200;S19960127的Ct值为17.56,RFU峰值>1000;阴性对照RFU峰值<200。实验结果显示海南州鼠疫疫源地87株鼠疫菌基因序列第128位的碱基未发生A→G突变,该疫源地未检出耐链霉素鼠疫菌株。结论海南州鼠疫疫源地87株鼠疫菌对链霉素均敏感。鉴于细菌耐药性基因的产生与传播特征,应持续开展监测并建立鼠疫菌耐药性监测网络,以便能及时发现并控制耐药菌的传播。

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

目的探索尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌(MT)L型的耐药基因rpsL突变与耐受链霉素(SM)的关系。方法用PCR-SSCP方法检测rpsL基因,与采用常规SM药敏试验(AST法)的结果进行对比分析。结果采用AST法检测,52株结核分枝杆菌L型临床分离株中共有26株(50.0%)耐SM;PCR-SSCP法检出rpsL基因突变率为40.4%(21/52),2种方法检测耐药株的符合率为80.8%。结论结核杆菌L型对SM的耐药与rpsL基因突变有关。

广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究

目的本研究主要针对从广东地区500例疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药情况与其对应的突变基因katG、rpoB、rpsL关系研究。方法采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB和rpsL基因进行序列分析。结果分离得到耐INH35株、耐RFP27株、耐SM25株。INH耐药株katG基因突变率为71.4%(25/35),RFP耐药株rpoB基因的突变率为81.5%(22/27),SM耐药株rpsL基因突变率为76%(19/25);INH以Ser315Thr突变60%(21/35)最常见,RFP以Ser531Leu突变55.6%(15/27)最常见,SM以Lys43Arg位氨基酸突变72%(18/25)常见。结论 katG、rpoB和rpsL基因突变被证实是广东地区结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性。