ELISA联合RT-nPCR检测慢性丙型肝炎病毒感染者结果分析

目的对比酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测慢性丙型肝炎病毒感染者血清抗-HCV和HCVRNA结果。方法2005年5月对河北赵县某农村单采血浆还输血细胞HCV感染者133人及健康对照52人共185人采集空腹静脉血。该感染人群于1990年前单采血浆还输血细胞时感染、1993年被现场调查、血清生化指标及病原学标志检查确诊为HCV感染者、2002年追踪调查仍明确诊断者。用ELISA法检测抗-HCV,用RT-nPCR检测HCVRNA。结果①185份血清标本中,抗-HCV和HCVRNA均阳性者92份,占49.73%;抗-HCV阴性、HCV-RNA阳性者18份,占9.73%;抗-HCV阳性、HCV-RNA阴性者22份,占11.89%,两者均阴性53份,占28.65%。两种方法检测结果一致符合率为78.38%[(92+53)/185],检测不一致率差异无显著性(配对χ2=0.40,P>0.05);②ELISA法检测慢性HCV感染者的灵敏度为82.71%,特异度为92.31%,漏诊率为17.29%;RT-nPCR检测的灵敏度为81.20%,特异度为96.15%,漏诊率为18.80%,两种方法检测灵敏度差异无显著性(χ2=0.102,P>0.05);③并联试验检测其灵敏度为96.75%,特异度为88.76%,其灵敏度明显高于单一ELISA法82.71%(χ2=9.62,P<0.01)。结论单独用ELISA法检测抗-HCV约有17%的漏检率,同时用RT-nPCR检测HCVRNA,可明显提高HCV感染者的阳性检出率。

猪瘟病毒RT-nPCR检测方法的建立及陕西部分地区猪瘟病毒E0基因分子特征分析

【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒(CSFV)RT-nPCR检测方法,为临床诊断提供一种可靠方法,同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析,揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征,为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列,设计并合成了2对引物,建立猪瘟RT-nPCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测,并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L,从BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV等参考毒株中提取或反转录获得的DNA/cDNA中不能扩增出目的条带,提示方法灵敏度高、特异性强。对32份疑似猪瘟组织病料的检测发现,有12份呈现阳性,阳性率为37.5%。序列分析表明,8株流行毒株间E0核苷酸、氨基酸同源性分别在97.0%~99.3%和94.8%~98.5%。与参考毒株的核苷酸同源性为83.4%~95.4%,氨基酸同源性为85.8%~98.1%。流行毒株与我国疫苗毒株HCLV、C HVRI的核苷酸同源性仅为83.4%~85.1%,氨基酸同源性仅为86.1%~89.1%,呈现出较明显的远离疫苗株的变异趋势。进化树分析发现,8个流行毒株均属于基因Ⅱ群。首次发现了1株流行毒株(SXWN02株)E0Rnase活性基序位点第94位由E变异为K,其他位点未发生变异。【结论】建立的RT-nPCR检测方法灵敏度高、特异性强,可作为猪瘟病毒的临床诊断方法。陕西部分地区猪场猪瘟感染仍较严重,需要做好防控工作。流行毒株E0基因发生较大变异,尤其是在关键位点上出现变异毒株,需要密切关注。

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高 。

树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法,为树鼩的质量控制提供检测方法。方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒,经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)。根据GenBank中已发表的MRV L1基因的保守区域,设计合成巢式引物,对所分离的三株树鼩呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT-nPCR扩增,优化反应条件,进行特异性、敏感性试验。应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测。结果针对分离到的三株树鼩呼肠孤病毒的RNA进行RT-nPCR扩增,均得到513 bp的特异性目的片段,培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带。敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0.01 pg/μL。25只树鼩粪便样本经RT-nPCR检测,有14只TRV阳性,其中死亡动物组10只,检出率为100%;存活动物组15只,检出率为27%。结论建立的TRV RT-nPCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于TRV的常规检测。

应用RT-nPCR检测石蜡包埋甲状腺癌中PTC癌基因的表达

为探讨ret原癌基因活化形式—PTC癌基因在甲状腺癌发病机制中的作用和判断其生物学行为,运用RT-nPCR技术检测16例甲状腺乳头状癌、4例滤泡癌、2例未分化癌、1例髓样癌PTC癌基因mRNA的表达,结果表明:16例甲状腺乳头状癌中有7例(43％)PTC基因表达为阳性,甲状腺滤泡癌、髓样癌及未分化癌均为阴性。在甲状腺乳头状癌中,PTC表达阳性组多伴有淋巴细胞浸润(57％),高于阴性组病侧(11％)(P<0.05),而与患者发病年龄、肿瘤大小及淋巴结转移无显著相关性。因此,我们认为ret原癌基因的活化与甲状腺乳头状癌的发生有关,其活化形式—PTC癌基因的表达仅限于乳头状癌,可作为甲状腺乳头状癌的诊断和鉴别诊断的有效参考指标。

动物戊型肝炎病毒(HEV)RT-nPCR检测方法的建立及应用

根据戊型肝炎病毒(HEV)的4个基因亚型,寻找其保守序列ORF2,成功设计了一套以Ⅰ、Ⅳ型为主兼顾Ⅱ、Ⅲ型的通用简并引物,摸索条件,建立检测动物戊型肝炎病毒反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)的方法,扩增片段为507 bp。该方法检测所需时间为5 h,灵敏度可达10 pg,特异性强、重复性好;经优化研制了动物戊型肝炎病毒RT-nPCR检测试剂盒,保存期半年以上,该试剂盒可用于动物粪便、胆汁HEV RNA的检测。

2018—2020年福建地区猪瘟病毒E0基因遗传变异分析

为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况,收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份,采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测,对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示,CSFV总体阳性率为1.9%(29/1464),并获得13株CSFV E0基因序列。同源性分析发现所得13株CSFV E0基因之间的同源性在82.2%-99.7%,其中11株CSFV E0基因与1.1亚型代表毒株HCLV的核苷酸同源性为99.0%~99.9%,与Shimen株的核苷酸同源性94.1%~95.0%;1株与2.1c型参考毒株HNSD-2012核苷酸同源性为98.2%;1株与2.1d亚型毒株CSFV/JPN/2018核苷酸同源性为99.6%。遗传进化分析发现,10株CSFV与HCLV、C-ZJ-2008、Shimen和Brescia处于同一分支,属于1.1亚型;1株CSFV与HNSD-2012等位于同一分支,属于2.1c亚亚型;1株与CSFV/JPN/2018等位于同一分支,属于2.1d亚亚型。氨基酸序列分析发现,13株毒株与HCLV等代表毒株在重要的Rnase活性位点高度保守,其中2株2.1亚型毒株与HCLV毒株相比,其在第35位非关键氨基酸残基上发生由G→E的突变。结果表明福建地区CSFV流行情况趋向多样化,提示仍需加强对CSFV流行及遗传变异的持续监测,为猪瘟的诊断及有效防控奠定基础。

中国五省市甲型肝炎病毒基因分型的研究

为了解甲型肝炎 (甲肝 )病毒 (HAV)在中国几个城市的基因型分布 ,选择浙江杭州、江苏启东、安徽铜陵、云南昆明和上海市等的甲肝病人粪便标本或血清标本 ,以逆转录 -套式聚合酶链反应 (RT nPCR)扩增合成HAVVP1/2A交接区基因区 ,并进行直接核苷酸序列分析和差异比较。结果表明 ,从这些城市甲肝病人分离到的 17株HAV株均属基因Ⅰ型 ,为IA和IB亚型 ;所有HAV株间核苷酸差异均小于 15 % ,但约 5 0 %HAV株株间核苷酸差异大于 7 5 % ,说明中国流行或散发的HAV株可能有基因IA、IB亚型同时存在。该项研究结果将为HAV的分子流行病学追踪调查提供方法和依据。

牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。

上海地区猪戊型肝炎病毒部分序列的克隆与分析

对上海地区几个猪场的戊型肝炎感染情况进行了调查,共采集粪便样品36份,通过RT-nPCR的方法应用通用引物对病毒基因组的ORF2部分片断进行扩增,36份样品中有5份RT-nPCR阳性,HEV RNA阳性率为13.9%,去除相同的序列,得到2株HEV的ORF2部分序列。序列分析表明,这两段序列与基因I、II、III、IV的遗传距离分别为0.183、0.207、0.230、0.102和0.177、0.226、0.240、0.108。系统进化分析显示,这两株病毒都属于基因Ⅳ型。

O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立

为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR(RT-nPCR)方法。该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍。利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型。实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查。

检测猪戊型肝炎病毒的荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中猪戊型肝炎病毒的ORF2核苷酸序列的保守区域设计合成一对特异性引物,建立了一套SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测猪源戊型肝炎病毒(swHEV)的方法,并评价了该方法的灵敏度、稳定性和特异性,同时与常规的RT-nPCR进行对比分析。结果表明,建立标准曲线的相关系数为0.998,斜率为-3.039,Ct值变异系数(CV)在0.17%～1.41%之间,有良好的稳定性。同时在检测猪群常见病中显示出很好的特异性,并且比RT-nPCR更灵敏,适合于swHEV的检测。

猪瘟病毒感染仔猪接种猪瘟疫苗后抗原的跟踪检测

为了解猪瘟病毒感染仔猪免疫猪瘟疫苗后带毒情况,并比较实验室几种猪瘟抗原检测方法的适用性,采用(CSFV)RT-nPCR、猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR(HCLV-FQ-PCR)和CSFV实时荧光定量RT-PCR(CSFV-FQ-PCR)3种检测方法对田间感染CSFV仔猪疫苗免疫前后带毒情况进行定期跟踪检测。结果显示:本实验室建立的CSFV-FQ-PCR灵敏度高于CSFV-RT-nPCR;猪瘟疫苗免疫48 d后,采用HCLV-FQ-PCR方法检测不到血液中的HCLV;猪瘟病毒感染猪免疫疫苗后仍存在持续带毒现象,因此对猪瘟病毒感染猪必须彻底淘汰。

甲状腺癌中ret/ptc癌基因表达的研究

目的探讨ret原癌基因活化形式ret/ptc癌基因在甲状腺癌发病机制中的作用和判断其生物学行为。方法应用RTnPCR方法检测了37例甲状腺癌ret/ptc癌基因的表达,包括乳头状癌为26例,滤泡癌8例,髓样癌2例,未分化癌1例。结果26例甲状腺乳状癌中有11例表达为阳性,阳性率为42.3%,8例滤泡癌、2例髓样癌和1例未分化癌均表达为阴性。组织学观察显示,ret/ptc阳性组病例多伴有淋巴细胞浸润(63.6%),显著高于阴性组病例(20.0%,P<0.05),临床病理资料显示,患者发病年龄平均为28.9岁,显著低于阴性组病例的45.9岁(P<0.05),而与患者性别,肿瘤大小,淋巴结转移无显著相关性,随访结果表明在复发病例中无ret/ptc阳性表达病例。结论我们认为ret原癌基因的活化与甲状腺乳头状癌的发生有关,具有ret/ptc癌基因阳性表达的患者一般发病年龄较小,肿瘤恶性程度不高,患者预后相对较好,可作为临床上诊断及判断其生物学行为的参考指标。

猪瘟病毒三种实验室诊断方法的比较研究

为了探讨反转录-复合巢式聚合酶链式反应（RT-nPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、猪瘟病毒抗原胶体金检测试纸条三种实验室诊断方法在临床中检测猪瘟病毒的适用性,笔者从承德地区规模化种猪场采集疑似猪瘟病毒的血液、淋巴结等病料40份,采用RT-nPCR、ELISA、猪瘟病毒抗原胶体金检测试纸条三种实验室方法进行检测。结果表明：RT-nPCR检测出8份阳性样品,阳性率为20.0%;ELISA抗原检测法检测出10份阳性样品,阳性率为25.0%;猪瘟病毒抗原胶体金检测试纸条检测出13份阳性样品,阳性率为32.5%。说明猪瘟病毒抗原胶体金检测试纸条检测阳性率较高,但准确性较低,操作比较简单,适用于基层;RT-nPCR和ELISA抗原检测猪瘟病毒特异性好、准确性高,但需要相应的仪器和技术,适用于规模化养殖场,且RT-nPCR检测能准确地区分猪瘟病毒的强毒株和弱毒株。因此,建议在临床上选用RT-nPCR和ELISA抗原检测两种方法检测猪瘟病毒。

柳州市急性散发性戊型肝炎病毒(HEV)部分核苷酸序列分析

应用逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）法检测柳州市７例散发性戊型肝炎病人急性期血清，６例ＨＥＶＲＮＡ阳性（８５．８％）。对其中２份阳性ＰＣＲ产物纯化后，直接测定其核苷酸序列，并与ＨＥＶ墨西哥株（Ｍ）、缅甸株（Ｂ）、中国流行株ＣＨ１．１进行比较。该２株ＨＥＶ散发株与ＨＥＶ（Ｍ）、ＨＥＶ（Ｂ）、ＨＥＶＣＨ１．１的核苷酸同源性分别为８０．８％、９２．４％～９２．７％、９７．５％～９７．７％。结论，该２株ＨＥＶ散发株与ＨＥＶ（Ｂ）和ＣＨ１．１为同一亚型。

太原市庚型肝炎病毒感染状况调查

采用抗ＨＧＶ酶联免疫试验（ＥｌＡ）和逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴｎＰＣＲ）对１００例乙型肝炎、９８例丙型肝炎、１００名供血员和９３名健康人群进行了检测。结果抗ＨＧＶ阳性率分别为１６．０％、１３．３％、９．０％和３．２％；抗ＨＧＶ阳性者的ＨＧＶＲＮＡ阳性率分别为６８．８％、７７．８％、１００％和１００％，提示太原市不同人群中存在庚型肝炎病毒感染；乙型肝炎和丙型肝炎病人及供血员的庚型肝炎病毒感染率显著高于健康人群；乙型或丙型肝炎病人合并感染庚型肝炎病毒似不加重病情。

江西部分地区猪粪便戊型肝炎病毒核酸检测及序列分析

采集江西省A猪场2-3月龄猪粪便40份,B猪场2-3月龄猪粪便40份,利用反转录套式聚合酶链方法（RT-nPCR）,检测戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）RNA,结果表明,A猪场7份样品为阳性,阳性率17.5%。B猪场10份样品为阳性,阳性率25.0%。总阳性率21.3%。对4份PCR扩增阳性产物进行纯化并测序,利用生物学软件进行序列分析和进化树绘制,4个分离株ORF2 348 bp同源性为92.1%-97.5%,为同一基因型,与HEV1、HEV2、HEV3同源性分别为70.7%-77.4%、72.5%-75.7%和71.6%-76.8%,与HEV4型的同源性79.2%-83.9%。4个分离株与HEV4型的代表株T1在同一分支上,属基因4型。与中国大陆6株猪源HEV比较,同源性为79.0%-87.3%,提示中国大陆猪源HEV的基因型比较一致,同属HEV 4型。

中国大陆2a型丙型肝炎病毒基因组5′非编码区的一级结构及其变异

目的 了解中国大陆丙型肝炎病毒 (HCV) 2a型基因组 5’非编码区的核苷酸序列 ,研究其序列变异特征。方法 以限制性片段长度多态性分析法 (RFLP)初步筛选出 2例 2a型HCV感染者 ,用逆转录套式PCR(RT nPCR)法从其血清中分别扩增出长约 60 0bp的片段 ,以限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切后克隆于 pUC1 9载体中 ,转化感受态细胞 ,以RFLP法鉴定为阳性克隆后 ,用全自动序列分析仪测序。结果 2条分离株 (HCV JFB1 ,HCV JFB2 )均测得约 60 0bp的核苷酸序列 ,将 5’端 2 80个核苷酸分别与HCV 1、HC C2、HC J5、HC J6、HC J85’UTR相应序列作比较 ,其同源性在 92 8%～ 99 6 %。同时发现分离株也存在多个碱基突变。结论 HCV5’UTR高度保守 ,2a型HCV基因突变以碱基的转换为主 ,其中一分离株 (HCV JFB1 )