Red/ET同源重组介导的基因克隆载体pBACS的构建、鉴定与应用

目的通过Red/ET同源重组技术构建pBACS基因克隆及测序质粒载体。方法以质粒pBAC2015、pET28a为模板设计四对引物,PCR扩增得到四段彼此间有50 bp同源区域的基因片段,分别命名为bac-sop、bac-ori、bac-kan和bac-T7。利用Red/ET同源重组技术,将四段基因片段电转至E.coli GB05-dir感受态中进行线线重组。经酶切、测序验证阳性克隆质粒。此外,对重组质粒pBACS进行稳定性鉴定;利用pBACS分别进行细菌16S rDNA和真菌ITS基因克隆和基因测序。结果酶切和测序的验证结果显示,质粒的大小、元件方向及序列正确;pBACS具有较强的稳定性,适用于作为基因工程的克隆载体;可高效用于细菌16S rDNA和真菌ITS序列的克隆,阳性率为100%。结论成功利用Red/ET技术构建克隆载体pBACS,质粒载体具有稳定性强、重组效率高的特点,在基因克隆和基因测序等方面具有良好的应用潜力。

Red/ET同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体(BAC)进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节.应用新近优化的Red/ET同源重组技术对目标BAC进行修饰,以pSC101-BAD-gbaA为依托质粒,采用rpsL鄄neo为正/反向筛选系统,可以快速、高效地对BAC进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步BAC修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因Cre为代表的两步BAC修饰在两周内即可完成.通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使pSC101-BAD-gbaA依托质粒在发挥完Red/ET同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后BAC,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台.

通过减毒和Red/ET同源重组构建跨界基因沉默菌株

"跨界基因沉默"技术是一种全新的、跨原核界与真核界的小分子RNA干扰传递技术。该技术构建了一种大肠杆菌,在这种大肠杆菌中转录的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)能够引发真核细胞内特异性基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi),所以此大肠杆菌又被称为"跨界基因沉默菌株"。"跨界基因沉默菌株"具有RNA干扰传递功能,主要得益于"跨界干扰质粒"(trans-kingdom RNAi plasmid,TRIP)。TRIP质粒主要包含inv基因、hly基因以及能够转录shRNA的基因片段。hly基因表达的listeriolysin O蛋白可以帮助细菌逃离真核细胞的吞噬体,但listeriolysin O蛋白是一种重要的毒力因子,对宿主细胞具有一定的损害。为了克服这种缺陷,在hly基因上设计了△PEST和G486D两种减毒突变。同时,为了使减毒后的TRIP质粒能够在"跨界基因沉默菌株"中稳定存在,进一步利用Red/ET同源重组将该质粒整合进大肠杆菌的基因组中。实验结果表明,减毒、整合后的"跨界基因沉默菌株"能更好地发挥RNAi作用。该技术的完善将推进工程菌的研发和利用。

Red/ET同源重组技术在载体构建中的应用

Red/ET同源重组技术是以原有的重组技术为基础,利用Rac噬菌体ET系统或者λ噬菌体的Red系统进行外源基因重组的重组方法。该方法使同源重组过程变得更方便快捷。本文对Red/ET同源重组技术的原理,改进和载体构建方面的应用做了综述。

Red/ET同源重组技术在载体构建中的应用

Red/ET同源重组技术是以原有的重组技术为基础，利用Rac噬菌体ET系统或者噬菌体的Red系统进行外源基因重组的重组方法。该方法使同源重组过程变得更方便快捷。本文对Red/ET同源重组技术的原理，改进和载体构建方面的应用做了综述。

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.

Red/ET同源重组技术及其在微生物基因组挖掘中的应用进展

Red/ET同源重组技术(Red/ET recombineering)是由来源于大肠杆菌λ噬菌体的蛋白对Redα/Redβ或来源于Rac原噬菌体的蛋白对Rec E/Rec T所介导的基于短同源臂(40–50 bp)的同源重组技术,能对宿主DNA序列进行快速、高效、精确的修饰和操作。本文主要综述了2010年以来Red/ET同源重组技术在大肠杆菌及其他细菌中的研究进展,同时简要介绍了该技术在微生物基因组挖掘,尤其是在微生物基因簇的异源表达领域的应用进展。

Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展 ,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成 :Exo蛋白是一种核酸外切酶 ,结合在双链DNA的末端 ,从 5′端向 3′端降解DNA ,产生 3′突出端 ;Beta蛋白结合在单链DNA上 ,介导互补单链DNA退火 ;Gam蛋白可与RecBCD酶结合 ,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短 ( 4 0～ 60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作 ,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外 ,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上 ,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 。

Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用

基因敲除是研究基因功能最直接的方法。对于大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂。Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟。作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项。大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考。

用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。

Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用

Red同源重组技术发展迅速,已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰,在点突变、基因敲除、序列整合等方面发挥着重要作用。简要综述了Red同源重组的重组机制和操作策略等研究进展,并介绍了Red同源重组在大肠杆菌基因组减小及多基因代谢途径优化方面的应用情况。

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB,为发光光状杆菌基因敲除提供方法。采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上,获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB;采用Red/ET方法分别将Gentar基因和Aprar基因分别插入pTA-cipA和pTA-cipB的cipA和cipB基因中,并替换cipA和cipB基因部分序列,获得pTA-GentaIncipA和pTA-ApraIncipB;pTA-GentaIncipA通过BamHⅠ酶切,从0.7%琼脂糖胶上回收获得GentaIncipA,将GentaIncipA导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescenssubsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipA;pTA-ApraIncipB用EcoRⅠ酶切,从0.7%琼脂糖胶上回收获得ApraIncipB,将ApraIncipB导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescenssubsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipB;42℃下热激去除突变菌中的质粒pASK-αβγA。克隆PCR和SDS-PAGE电泳结果表明发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB均被敲除。采用RED同源重组法成功地敲除了发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB。

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.

Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用

通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一个传统型基因敲除打靶载体的构建;结合Cre-loxP系统,在传统型基因敲除打靶载体的基础上,经过再一轮的Red/ET重组就能够成功实现条件性基因敲除打靶载体的构建。整个实验过程不需要PCR扩增长、短臂序列,也不涉及酶切、连接反应,因此,不仅省时、省力,而且所构建的基因打靶载体序列准确,无突变。实验方法的建立为加速后基因组时代的基因功能研究提供了一条捷径。

Red同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用

近年来,大肠埃希菌一直是分子生物学和基因组学的重要研究对象。20世纪80年代以来,生物学家发展了一种新型分子生物学技术-基因敲除。大肠埃希菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。本文简要综述了利用Red同源重组技术进行大肠埃希菌基因敲除的原理、策略及应用现状。

Red/ET重组及其在生物医学中的应用

通过应用Rac噬菌体的RecE RecT和λ噬菌体的RedαRedβ系统而建立的DNA工程平台———Red ET重组,是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、融合及突变等多种操作,在生物医学领域里具有广阔的应用前景,尤其在基因组功能研究中对BACs、PACs和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA靶分子的快速构建等方面最有效。随着Red ET重组的推广与应用,该技术本身也在不断被改进,在工作效率得到显著提高的同时,其操作也变得更加简单、省时、省力。结合自身的一些研究结果,对Red ET重组的技术特点、发展现状和在生物医学中的应用进行了详细阐述。

Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用

大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。

同源重组的好工具,Red重组系统

随着分子生物学实验技术的不断提高,对基因功能的研究不断深入,迫切需要一种新的生子生物学技术来使某个相关基因沉默,或是被替换。近年来,应用Red重组系统对微生物上相关基因的敲除这门技术在生物学领域得到了广泛的应用。本综述即对该技术作出一个比较科普性的介绍,并附带对传统的RecA重组作出介绍。

细菌λ Red重组技术的应用及其影响因素

由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta和Gam蛋白组成λRed同源重组系统。λRed重组是细菌靶基因置换的有效技术,该技术发展迅速,已广泛应用于大肠埃希菌等细菌染色体DNA的基因敲除、基因整合,可以对任何大小的DNA分子进行精确修饰。利用λRed重组系统不仅可以构建工程菌,还可以为研究细菌的致病机理和耐药机制提供新的方法。然而,许多应用因重组频率而受到限制,影响重组频率的因素主要有底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等。论文综述了λRed同源重组技术的应用进展及影响重组的因素,以期为优化重组试验方案及提高试验的成功率提供帮助。

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。