苗药紫金牛、铁扫帚组方干预慢性阻塞性肺疾病大鼠气道Wnt通路RhoA基因与TGF-β_(1)、MMP-9的相关性研究

目的研究苗药紫金牛、铁扫帚组方干预COPD大鼠气道Wnt通路RhoA基因与TGF-β_(1)、MMP-9的相关性,从而探讨苗药紫金牛、铁扫帚配方干预COPD大鼠气道重塑的调控机制。方法构建COPD大鼠模型,进行气道成纤维细胞的培养,采用ELISA检测气道成纤维细胞上清液中TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子的含量,并运用Westernblot方法检测气道成纤维细胞中RhoA基因蛋白的表达,从而研究RhoA基因表达与TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子的相关性及苗药紫金牛、铁扫帚的影响。结果与正常组相比,COPD大鼠模型组气道成纤维细胞上清液中TGF-β_(1)、MMP-9的含量升高,同时RhoA基因在也是表达增高。经苗药紫金牛、铁扫帚治疗后,细胞因子TGF-β_(1)、MMP-9与RhoA基因的表达则降低,从而得出TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子与RhoA基因呈正相关。结论COPD大鼠气道成纤维细胞上清液中TGF-β_(1)、MMP-9细胞因子是COPD大鼠气道重建中成纤维细胞增殖的关键因子。而RhoA基因对组织纤维化有关,且能调控细胞因子TGF-β_(1)、MMP-9。苗药紫金牛、铁扫帚能够抑制炎性因子TGF-β_(1)、MMP-9的表达及WNT通路的RhoA基因的增殖,从而寻求苗药紫金牛、铁扫帚配方干预COPD气道重塑的机制。

基于RhoA/ROCK通路探讨益智仁对糖尿病肾病防治作用及机制研究

目的研究益智仁(Alpinia Oxyphylla Fructus,AOF)对糖尿病肾病的防治作用及机制。方法用浓度为30 mmol/L的高糖培养基诱导HK-2细胞48 h造模,实验分为正常组、模型组、卡格列净组、益智仁组,药物处理24 h,采用Western-blot和qPCR技术检测RhoA/ROCK信号通路上的相关蛋白和基因表达变化。流式细胞术检测细胞凋亡、CCK-8检测细胞增殖、活性氧(ROS)检测氧化应激。结果与正常组比较,模型组HK-2细胞的细胞活性降低,凋亡率增加,ROS含量升高,RhoA/ROCK信号通路上的基因和蛋白表达增加(P<0.05)。与模型组比较,益智仁组HK-2细胞活性升高,细胞凋亡率和ROS的含量降低,RhoA/ROCK信号通路上的基因和蛋白表达量降低(P<0.05)。结论益智仁通过抑制RhoA/ROCK信号通路促进HK-2细胞增殖及抑制细胞凋亡;降低了HK-2的炎性反应、氧化应激和改善肾小管上皮细胞纤维化对糖尿病肾病有一定的治疗作用。

慢病毒和质粒作为shRNA载体沉默人卵巢癌RhoA基因效果的比较

目的研究慢病毒和质粒作为RNA干扰载体在沉默卵巢癌RAS同源基因家族成员A(RhoA)基因表达方面的差异。方法分别将慢病毒及质粒载体携带的针对RhoA基因的siRNA序列感染或转染卵巢癌HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选建立稳定沉默RhoA基因的细胞株。通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR、Western blot法、血管形成实验、细胞划痕实验研究两种载体随着细胞培养代数的增加在抑制卵巢癌RhoA基因表达及侵袭和转移能力上的差异。结果采用质粒载体及慢病毒载体分别建立人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过荧光显微镜观察,质粒组细胞绿色荧光蛋白的表达率随培养代数的增加而下降;第15代、第25代时表达率分别为70%、45%,而慢病毒组细胞绿色荧光蛋白表达率维持在95%以上,实时荧光定量PCR及Western blot法发现质粒组和慢病毒组细胞在第3代时RhoA mRNA及蛋白的表达无明显差异;随培养代数的增加,慢病毒组RhoA mRNA及蛋白持续低表达,而质粒组RhoA mRNA及蛋白的表达逐渐增高;细胞划痕实验及血管形成实验表明慢病毒较质粒作为载体介导siRNA对RhoA基因沉默更能持续稳定地抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移(P<0.05)。结论慢病毒较质粒作为载体介导RNA干扰能更好沉默目标基因的表达。

体外RNA干扰RhoA基因对舌癌细胞侵袭的影响

目的应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113和SCC-4中Rho A基因的表达,探讨Rho A基因表达下调对舌癌细胞侵袭的影响。方法登录Genbank数据库确定人Rho A基因序列,针对Rho A的基因序列设计短链RNA,利用Lipofectamine2000介导法将Rho A-si RNA转染至舌癌Tca8113和SCC-4细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后的舌癌细胞中Rho A m RNA的表达,蛋白质印迹法检测Rho A、半乳糖凝集素-3(galectin-3)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果舌癌细胞转染Rho A-si RNA后,Rho A的基因和蛋白表达下降,galectin-3和MMP-9蛋白表达下降,细胞体外侵袭能力降低。结论 Rho A-si RNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4细胞中Rho A的表达,通过降低galectin-3和MMP-9的表达从而降低细胞的侵袭能力。Rho A在舌癌的侵袭和转移中可能发挥重要的作用。

抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌(BC)细胞凋亡的作用。方法通过已建立的RhoA腺病毒载体系统,感染BC MCF-7细胞。经过细胞培养、病毒滴度等,将收集的样本分别用Western blot、RT-PCR技术检测RhoA蛋白表达和基因表达变化;对感染Adsi RNA-RhoA的BC细胞进行MTT检测及细胞内DNA片段化检测。结果腺病毒siRNA-RhoA感染BC细胞能明显抑制RhoA基因表达(抑制率为75.64%),降低RhoA基因的mRNA转录水平69.44%。MTT检测结果表明,感染腺病毒Adsi RNA-RhoA组的肿瘤细胞生长、增殖被明显抑制。TUNEL检测显示,抑制RhoA基因表达能明显导致BC细胞凋亡。结论利用siRNA抑制BC细胞中RhoA基因表达,能诱导BC细胞凋亡。

慢病毒介导RhoA基因沉默对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响

目的:建立慢病毒介导RhoA基因稳定沉默卵巢癌HO8910细胞株,研究RhoA基因对HO8910细胞侵袭和迁移的影响。方法:构建靶向沉默RhoA基因的慢病毒载体Lenti-U6-shRhoA,将其感染HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选,建立稳定沉默RhoA基因的HO8910细胞。实时荧光定量PCR检测HO8910细胞中RhoA mRNA的表达;MTT检测HO8910细胞的增殖;Transwell体外迁移和侵袭实验检测RhoA基因沉默对HO8910细胞侵袭和迁移的影响。结果:成功构建靶向RhoA基因的慢病毒载体Lenti-U6-shRhoA,建立了RhoA基因稳定沉默的HO8910细胞。与Lenti-U6-NC对照组对比,RhoA基因稳定沉默HO8910细胞RhoA mRNA的表达明显降低[(30.7±5.40)%vs(95.9±6.53)%,P<0.05];沉默RhoA基因能降低HO8910细胞的存活率[(51.16±7.41)%vs(95.67±2.14)%,P<0.05];RhoA基因沉默组HO8910细胞的侵袭、迁移及黏附能力较Lenti-U6-NC对照组明显受到抑制[迁移穿过人工基底膜细胞数(31±6)vs(84±13)个,P<0.05;穿过微孔膜的细胞数(97±12)vs(689±23)个,P<0.05;黏附率(68.16±6.53)%vs(98.71±4.92)%,P<0.05]。结论:慢病毒介导的RhoA基因沉默能抑制卵巢癌HO8910细胞的侵袭和迁移。

RhoA在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的研究RhoA在人类肝癌(HCC)组织中的表达,并探讨RhoA与临床病理特征之间的关系。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(W estern b lot)的方法检测30例肝癌手术标本癌组织、癌旁组织中RhoAmRNA和蛋白表达的相对水平。结果RhoAmRNA和蛋白水平在肝癌组织中的表达均较癌旁组织高[吸光度(A)的比值分别为1.45±0.66和1.18±0.53、35.74±6.38和16.50±7.53],差异有显著性(P<0.05)。在肝癌组织中,RhoA mRNA和蛋白的表达量与肝癌的细胞分化程度、结节数目、有无淋巴结静脉浸润以及有无肝外转移灶有关(P<0.05),而与性别和肿瘤直径无关(P>0.05)。结论RhoA在人类肝癌中过量表达,并与肝癌的浸润和转移密切相关,可作为反映肝癌侵袭和转移能力的新指标,有望成为肝癌治疗的新靶点。

RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞移植脑损伤大鼠功能的恢复

背景:研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷,对神经修复具有抑制作用。目的:脐带间充质干细胞移植同时联合RNAi介导的RhoA基因沉默,观察两者对脑损伤大鼠恢复的影响。方法:健康Wistar大鼠84只,采用液压颅脑损伤仪,给予253.3125-303.975kPa液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤模型,随机分成为对照组,脐带间充质干细胞移植组,联合组(脐带间充质干细胞移植联合RhoA基因沉默)。CM-Dil标记的脐带间充质干细胞移植后采用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况,在创伤性脑损伤后21-28d进行Morris水迷宫试验。4周后处死并行全脑冷冻切片苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察CM-Dil标记的脐带间充质干细胞的存活和分布情况,采用RT-PCR检测各组损伤区脑组织RhoA基因的表达量。结果与结论:移植后1,2,3,4周,大鼠神经学缺损评分脐带间充质干细胞移植组低于对照组(P<0.05),联合组明显低于对照组(P<0.01)。Morris水迷宫试验各组平均逃避潜伏期均逐渐缩短,联合组3-5d时平均潜伏时间较脐带间充质干细胞移植组缩短(P<0.05),较对照组明显缩短(P<0.01);联合组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于对照组和脐带间充质干细胞移植组(P<0.05)。移植4周后,脑组织冰冻切片和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量和CM-Dil阳性细胞数联合组多于脐带间充质干细胞移植组,脐带间充质干细胞移植组多于对照组(P<0.05);联合组RhoAmRNA表达水平较对照组和脐带间充质干细胞移植组显著降低(P<0.05)。提示脐带间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用RhoA基因沉默有协同效果。

miR-200c调控RhoA基因表达介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制的研究

目的研究miR-200c调控Ras基因家族成员A(RhoA)表达介导RMP7增加血肿瘤屏障(BTB)通透性的机制。方法应用real-time PCR检测RMP7作用BTB后人脑微血管内皮细(ECs)miR-200c的表达;应用miR-200c模拟物和miR-200c抑制物分别转染GECs(ECs和U87脑胶质瘤细胞共培养的细胞),测量跨内皮阻抗值(TEER)、辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量,分析BTB通透性;应用Western blotting检测RhoA的表达;应用免疫荧光方法观察GECs中RhoA表达和分布;应用双荧光素酶报告基因检测miR-200c转录后水平调控RhoA机制。结果 RMP7作用GECs后,使GECs内源性miR-200c表达显著降低;miR-200c模拟物和miR-200c抑制物成功转染到GECs中;miR-200c模拟物显著抑制RMP7诱导TEER值的降低、HRP的升高;miR-200c模拟物显著减少RhoA的表达,促使RhoA在GECs细胞质和细胞核分布减少;miR-200c模拟物转录后水平负性调控RhoA基因表达。miR-200c抑制物与miR-200c模拟物实验结果相反。结论 miR-200c转录后水平负性调控RhoA表达,介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制。

RhoA基因在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系

目的:探讨RhoA基因在胰腺癌组织中的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系。方法:应用实时荧光定量PCR与Western blot同步检测48例胰腺癌患者癌组织及对应癌旁组织中RhoA mRNA及蛋白的表达情况,分析RhoA基因的表达与胰腺癌组织临床病理参数的关系。结果:肿瘤组织中RhoA mRNA的表达量明显高于癌旁组织(t=3.669,P=0.0007),RhoA mRNA在胰腺癌中的表达水平与肿瘤分化程度、有无门脉及淋巴结转移、pTNM病理分期密切相关,在中、低分化肿瘤(t=2.447,P=0.006)、门静脉受侵犯(t=2.544,P=0.008)、淋巴结转移(t=2.351,P=0.041)和pTNM分期较晚(Ⅲ和Ⅳ期,t=2.667,P=0.025)的患者中明显升高。Western blot结果显示肿瘤组织中RhoA蛋白的表达水平明显高于癌旁组织(t=3.461,P=0.0003);RhoA蛋白表达量与肿瘤侵袭能力以及肿瘤分期相关,RhoA蛋白的含量在中、低分化肿瘤(t=2.323,P=0.016)、门静脉受侵犯(t=2.119,P=0.036)、淋巴结转移(t=2.117,P=0.029)和pTNM分期较晚(Ⅲ和Ⅳ期,t=2.776,P=0.004)的患者中明显升高。结论:RhoA基因可能成为一种新的肿瘤标志物,用于判断肿瘤分化程度、转移能力和预后评估。

DLC1和RhoA表达对乳腺癌淋巴道转移的影响

目的探究肝癌缺失基因1(DLC1)与RhoA表达对乳腺癌淋巴道转移的影响。方法收集已发生淋巴结转移的乳腺癌病变组织标本25例,未发生淋巴结转移的乳腺癌病变组织标本30例,采用免疫组化(SP)法检测DLC1与RhoA在两组标本中的表达情况,应用统计学方法对实验结果进行分析。结果在发生转移和未发生转移的乳腺癌病变组织中DLC1阳性率分别为44.00%和73.33%(χ2=4.889,P=0.027),RhoA阳性率分别为92.00%和50.00%(χ2=11.264,P=0.001),spearman等级相关分析显示DLC1与RhoA在乳腺癌病变组织中的表达呈负相关(r=-0.454,P=0.000)。结论乳腺癌淋巴道转移与DLC1低表达、RhoA高表达密切相关。

RhoA、C干扰载体的构建及其对直肠癌HCT116细胞相应基因表达的影响

目的构建RhoA和RhoC干扰载体,观察其对结直肠癌细胞内RhoA和RhoC基因表达的抑制作用。方法设计合成针对人RhoA和RhoC基因序列的各4对含有小发夹结构的寡核苷酸序列,将其连入pGensil-1质粒中,构建特异性shRNA表达载体并转染结直肠癌细胞HCT116。应用荧光定量PCR法检测HCT116细胞中的RhoA和RhoC mRNA。结果成功构建了特异性shRNA表达载体,将其转染HCT116细胞后,细胞内RhoA和RhoC mRNA的表达水平与未转染组相比,P<0.05。结论构建的RhoA和RhoCshRNA干扰载体能有效抑制HCT116细胞的RhoA mRNA和RhoC mRNA表达。

RhoA对食管癌Eca-109细胞VEGF表达的调控作用

目的探讨小G蛋白超家族成员RhoA对食管癌Eca-109细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的调控作用。方法食管癌Eca-109细胞转染过表达RhoA质粒(V14RhoA)或沉默表达RhoA质粒(shRhoA)后,采用Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)法分别检测其细胞内外VEGF蛋白表达,Western blotting和Real-time PCR分别检测Eca-109细胞转染V14RhoA和shRhoA后p53和VEGF表达的情况。结果 Western blotting和ELISA法检测显示,Eca-109细胞转染V14RhoA后细胞内、外VEGF表达水平升高,而转染shRhoA后VEGF的表达被显著抑制。Western blotting和Real-time PCR检测显示,Eca-109细胞转染V14RhoA后p53表达显著降低,而VEGF表达显著升高(P<0.05)。结论食管癌Eca-109细胞中RhoA表达的变化可以引起细胞内外VEGF水平的变化,并且RhoA可通过抑制p53表达从而增加对VEGF的调控。

血管免疫母T细胞淋巴瘤患者RHOA、TET2和DNMT3A基因突变率及临床特征分析

目的探讨血管免疫母T细胞淋巴瘤(AITL)患者RHOA、TET家族羟化酶2(TET2)和甲基化转移酶3A(DNMT3A)基因突变率及临床特征分析。方法应用免疫组化法检测AITL患者组织中RHOA、TET2和DNMT3A的表达。采用多重PCR扩增和测序方法分析RHOA、TET2和DNMT3A突变主要基因型。结果免疫组化结果可知,RHOA阳性表达为68.33%(41/60)、TET2阳性表达为61.67%(37/60)和DNMT3A阳性表达为70.00%(42/60)。RHOA、TET2和DNMT3A阳性表达与血管免疫母T评分明显相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。RHOA、TET2和DNMT3A阳性表达与AITL患者性别及年龄不具有突变与血管免疫母T细胞淋巴瘤TNM分期、LDH含量、有无B症状及IPI评分明显相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 RHOA、TET2和DNMT3A突变可以作为诊断AITL的分子标志物,RHOA、TET2和DNMT3A突变可能参与调节AITL发生发展。

抑制细胞因子RhoA的表达对肝星状细胞株HSC-T6胶原分泌的影响

目的:观察并比较两种方法抑制RhoA的表达对细胞外基质成分,如Ⅰ型胶原、透明质酸以及层粘连蛋白合成的影响,为肝纤维化的基因治疗寻求新的途径.方法:设计并合成针对RhoA相同靶点的反义寡核苷酸和小干扰RNA,分别转染肝星状细胞株HSC-T6,逆转录PCR技术检测细胞中RhoA和Ⅰ型胶原mRNA的表达;Western blot检测细胞中RhoA蛋白质的表达;ELISA检测培养上清中透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)及PIIIP的含量.结果:转染RhoA反义寡核苷酸和小干扰RNARat1质粒后,HSC-T6中RhoA mRNA的表达分别由0.892±0.051、0.937±0.044降为0.113±0.024、0.212±0.042;蛋白质表达水平均明显下调;细胞内Ⅰ型胶原mRNA的表达分别由0.709±0.067、0.695±0.087降为0.436±0.037、0.201±0.044;细胞外基质成分如HA、LN及PIIIP的表达水平明显下降.两者相比,小干扰RNA具有更强的生物学效应.结论:靶向抑制细胞因子RhoA的表达可明显减少肝星状细胞株HSC-T6细胞外基质的合成,且小干扰RNA的效果明显优于针对同一靶点的反义寡核苷酸,显示RNAi技术应用于肝纤维化基因治疗的良好前景.

K-ras基因突变通过调节E-cadherin/β-catenin/p120蛋白复合体形成和RhoA蛋白活性对结肠癌细胞株Caco-2转移的影响

目的观察K-ras基因突变通过调节E-cadherin/β-catenin/p120蛋白复合体形成和RhoA蛋白活性对结肠癌细胞株Caco-2转移的影响,探讨其促进结肠癌转移的相关机制。方法将培养的结肠癌细胞株Caco-2分别给予空白质粒phr-GFP转染(对照组)、K-ras基因突变型质粒phr-K-ras(Val12)转染(转染组)、phr-K-ras(Val12)质粒转染+丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径特异性抑制剂PD98059处理(MAPK抑制组)和phr-K-ras(Val12)质粒转染+磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)途径特异性抑制剂LY294002处理(PI-3K抑制组),Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率,细胞免疫荧光检测E-cadherin、β-catenin蛋白表达及其在细胞内定位,Western blot检测细胞内p120蛋白的表达,免疫沉淀检测与E-cadherin结合的β-catenin蛋白水平,Pull-down实验检测RhoA蛋白活性。结果转染组Caco-2细胞的迁移率为(19.8±5.6)%,明显高于对照组的(14.0±4.2)%(P=0.001)和MAPK抑制组的(15.8±1.2)%(P=0.044),但与PI-3K抑制组的(17.5±2.8)%差异无统计学意义(P=0.095)。细胞免疫荧光检测结果显示,转染组细胞膜上的E-cadherin和β-catenin蛋白表达减少。Western blot检测结果显示,转染组和PI-3K抑制组细胞内p120总蛋白表达减少。免疫沉淀检测结果显示,转染组和PI-3K抑制组细胞内与E-cadhenn结合的β-catenin蛋白水平下降。Pulldown实验检测结果显示,转染组细胞内的RhoA蛋白活性增加。结论K-ras基因突变可以促进结肠癌细胞株Caco-2的转移,其可能是通过MAPK途径减少E-cadherin/β-catenin/p120蛋白复合体形成,增强RhoA蛋白活性来实现的。

右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

目的探讨右美托咪定(DEX)对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法建立VILI大鼠模型,将大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)。测定大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D);HE染色观察肺组织病理形态;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平;TUNEL染色法检测肺上皮细胞死亡;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及RhoA、ROCK1表达水平。结果DEX可以减轻VILI大鼠肺损伤,降低肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达(P<0.05),升高Bcl-2表达(P<0.05);LPA可以促使大鼠肺损伤加重,肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过抑制RhoA/ROCK1通路保护大鼠呼吸机相关性肺损伤。

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

为深入研究Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,Rhoa)和环氧合酶2(cyclooxygenase 2,Ptgs2)分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列(登录号:JN971019.1和NM_011198)设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用LipofectamineTM2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。

RhoA在食管癌中的表达及其机制研究

目的:研究RhoA基因在人食管癌中的mRNA表达及其与肿瘤发生的关系。方法:采用SYBR Green实时定量PCR技术检测30例食管癌组织及癌旁组织中的RhoA基因的mRNA水平。同时,采用免疫组化技术检测上述30例组织中RhoA的蛋白水平及分布。结果:与癌旁组织相比,RhoA基因在食管癌组织中mRNA水平较癌旁组织显著上调,癌旁组织中RhoA的表达为0.39±0.09,食管癌组织中RhoA的表达为0.94±0.25,与癌旁组织相比小上调2.4倍。免疫组化的结果也表明,RhoA基因在食管癌组织中表达要高于癌旁组织,并且主要分布于细胞浆。结论:RhoA基因在人食管癌中较癌旁组织表达显著上调,RhoA基因的表达与食管癌的发生密切相关。

白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建及RhoA基因表达的影响

目的:探讨白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建及其对于RhoA基因表达的影响。方法:60只Wistar大鼠分为六组,A组(正常对照组)、B组(阴性对照组)、C组(哮喘模型组)、D组(地塞米松组)、E组(白芥子散2 h组)以及F组(白芥子散4 h组),每组10只。造模成功后,A组、B组和C组正常饲养;D组腹腔注射地塞米松;E和F组背部剃毛,并在其双侧肺俞、脾俞、肾俞采用白芥子散分别艾灸2 h和4 h。检测和比较六组大鼠支气管肺泡灌洗液中的总细胞数、中性粒细胞数以及巨噬细胞数,白细胞介素-6和TNF-α的表达水平,以及肺组织中RhoA基因的蛋白质表达水平。结果:肺泡组织HE染色结构显示,采用地塞米松和白芥子散治疗2 h和4 h后肺泡结构的破坏,炎性细胞的浸润明显减轻。与正常对照组相比较,哮喘模型组支气管肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量均显著增加(均P<0.05),TNF-α和IL-6水平均显著增加(均P<0.05),肺组织中的RhoA基因的蛋白质表达水平显著增加。地塞米松和白芥子散2 h和4 h治疗显著减少了支气管肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量(均P<0.05),TNF-α和IL-6水平均显著增加(均P<0.05),减少了肺组织中的RhoA基因的蛋白质表达水平。结论:白芥子散可改善抗原诱导的大鼠哮喘,助其免疫稳态的重建,其作用机制可能是通过减少RhoA基因的蛋白质表达水平而实现的。