定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

基于GNSS-RTK水田平地机的设计与试验

设计了一种基于GNSS-RTK的水田平地机,并根据水田平整作业要求,设计了水田平地机的机械结构、液压及控制系统。控制系统基于GNSS-RTK卫星定位技术,采用Cortex M3系列控制器及RT-Thread嵌入式实时操作系统完成了平地铲高程的高精度检测,实现了平地铲高度的自动调节。田间试验结果表明:平地机机构设计合理,控制系统运行稳定可靠,平整精度满足要求。研究结果对水田平地机的设计具有一定的参考价值。

蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

地黄花叶病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

基于反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术建立了针对地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据ReMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列设计了3组LAMP引物,通过引物筛选确定最佳引物组合;利用电泳检测及可视化方法(加SYBR GreenⅠ显色剂)进行RT-LAMP温度优化、特异性检测、灵敏度比较。结果表明:本研究建立的RT-LAMP方法最适检测温度为60℃,优化后的LAMP方法能特异性检测ReMV,灵敏度是常规PCR的1000倍,可检测到1.2×10^(-1)拷贝/μL的模板浓度。对60份地黄样品的检测结果表明,RT-LAMP方法的阳性检出率为98.3%,高于常规RT-PCR方法(75%)。本研究建立的RT-LAMP检测技术为ReMV的准确检测提供了快速、高效的方法。

猪传染性胃肠炎病毒RT-CPA检测方法构建及初步应用

为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列,设计了3对引物,使用构建的重组质粒作为标准阳性对照,通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条,成功建立了一种一步法TGEV RT-CPA检测方法。本实验筛选最优条件为:Mg^(2+)浓度1.0 mmol/L,dNTP浓度0.8 mmol/L,Betaine浓度1.0 mol/L,BstDNA聚合酶浓度8.0 U,反应温度63℃,反应时间60 min,AMV逆转录酶5 U。本研究的扩增产物通过凝胶电泳显示出梯形条带,证明了其对TGEV的特异性检测和重复性良好,灵敏度高达10拷贝/μL。初步应用显示,该方法与TGEV抗原快速检测试剂盒的符合率超过90%,显示了高灵敏度。TGEV RT-CPA方法免去了RNA提取和cDNA合成的步骤,能够完成一步检测,且该方法不需要特殊仪器,适用于现场快速检测TGEV,为快速诊断和防控猪传染性胃肠炎提供了新的技术选择。

韦塞尔斯布朗病病毒RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的两种方法的核酸检测下限分别为10、100 copies/μL,对日本脑炎病毒、西尼罗病毒和坦布苏病毒核酸均无交叉反应;分别利用建立的两种检测方法对100份入境马匹样品进行检测,未检出WSLV阳性,与南非参考实验室提供的双重荧光RT-PCR检测方法结果一致。结果说明,所建的两种方法敏感性高、特异性强,可用于临床样本检测,为韦塞尔斯布朗病的出入境检验检疫、流行病学调查及防控提供了技术支撑。

闪光放射治疗(Flash-RT)技术的研究进展

经过多年发展,精准放射治疗技术已广泛应用,但现有技术仍受限于正常组织耐受剂量的限制,无法实现肿瘤治疗的最佳目标。闪光放射治疗(Flash-RT)是一种以超高剂量率射束(UHDR)进行照射的放射治疗技术,能够在显著降低正常组织辐射损伤的同时,最大限度地治疗肿瘤。但直到目前,Flash-RT的生物学机制、关键物理参数及触发机制等尚不明确,其原理及临床转化应用仍处于研究阶段。本综述通过归纳Flash-RT相关研究,阐明Flash-RT研究的技术进展及临床转化应用。

河南郑州桃园桃病毒T的RT-PCR检测

通过选取河南省郑州市周边桃园生长不正常的树体叶片,进行RT-PCR检测桃病毒T的感染。结果表明,18份样品中检测到了6份样品存在病毒感染,检出率为33.3%。检出病毒的桃树样品分布在新郑市多个乡镇的果园,共有5个品种检出病毒;来自巩义市的样品未检测出桃病毒T。检出病毒的桃品种既有生产上的老品种,又有近几年栽植的新品种。结合多个桃园的病毒检出,说明病毒T已在生产中存在较长时间,并在局部区域呈扩散趋势。

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。

基于RT-Thread的液压支架监控分站的设计

为提高煤矿生产的安全性和效率,降低生产成本,设计了基于嵌入式实时操作系统RT-Thread的液压支架监控分站。该分站通过CAN总线将综采工作面液压支架的工作数据上传到主站并接收主站下达的指令;此外,通过支架控制器可以实现对液压支架的远程控制。软件设计利用信号量和事件集进行线程间通信同步;同时采用多线程优先级抢占调度机制,实现任务的并发运行。实验证明,该分站具有精度高、可靠性强和实时响应等特点,达到工程实际应用需求。

PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。

荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较

为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度和检测成本高低七个方面对BVDV进行了综合性比较分析。结果表明:试验建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR、通用RTPCR方法相比具有特异性强、灵敏度高、样品检出率和扩增反应效率高、操作简便快速、低成本等特点。说明RT-LAMP方法对快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病、防止疫情的扩散具有重要意义。

闪光放射治疗(Flash-RT)在肿瘤治疗中的研究进展

闪光放射治疗(Flash-RT)作为放射治疗技术基础领域的关键性突破,可能引起放疗领域新的大变革。本文综述了Flash-RT在肿瘤治疗中应用和机制探索的最新研究进展。目前研究发现无论是电子束和光子Flash-RT还是质子FlashRT相较于常规剂量率放疗均可以降低对正常组织的损伤,但相关机制还未明确,包括但不限于氧耗竭、DNA损伤、细胞衰老、凋亡和免疫反应等。Flash-RT在肿瘤组织与正常组织损伤间的差异进一步减少了放疗的局限性,相较于常规放疗减少了不良反应和并发症,具有广阔应用前景。

面向松木表面缺陷检测的改进RT-DETR模型

为提高松木表面缺陷检测精确度,保证检测速率,该研究提出一种改进RT-DETR的检测模型RIC-DETR。首先,从木材表面缺陷公开数据集中获取图片,并进行标注及数据增强,构建一个包含13642张图片的表面缺陷数据集;其次,对比VGG11、VGG13、ResNet18和VanillaNet13等网络架构,选用计算复杂度低且检测精度较高的ResNet18作为主干特征提取基准网络;然后,引入反向残差移动模块更新ResNet18中的基本块,扩展模型的感受野,改善层间的特征交互;最后,使用EfficientViT模型中的级联分组注意力机制对反向残差移动模块进行二次创新改进,降低计算资源的消耗,提升模型的表达能力。试验结果表明,RIC-DETR的精确率、召回率、平均精度均值分别为95.4%、96.0%、97.2%,均优于目前主流的YOLO系列模型,对比基准模型RT-DETR,RIC-DETR在保持高精度的情况下,参数量、浮点运算量和内存占用量大幅减少,分别降低了54%、57%、52%,同时检测速度可达63.5帧/s。RIC-DETR模型具有复杂度低、准确率高、检测速度快的特点,可为松木的表面缺陷检测提供技术支持。

基于RT-DETR-Faster的苹果采摘机器人实时目标检测算法

为了解决苹果采摘中目标小,实时性要求高等问题,提出了一种基于RT-DETR的采摘机器人目标检测方法,名为RT-DETR-Faster。首先,采用FasterNet部分卷积替换主干网络的传统卷积,有效提升了模型的运算速度;其次,使用改进的级联注意力编码器替换原始的编码器,使网络更专注于目标区域;最后,引入Faster_Rep融合特征模块,保留更多有效特征并减少计算量。该文在实际的果园图像上进行了实验,结果表明,该文提出的算法与原始的RT-DETR算法相比,FPS提升了34%,帧数达到了47.9,同时准确率更高,适用于苹果采摘机器人的实时目标检测任务。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

柑橘3种病毒类病原多重RT-PCR检测技术的建立及应用

【目的】建立柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和啤酒花矮化类病毒(hop stunt viroid,HSVd)的多重RT-PCR检测体系。【方法】设计多重RT-PCR引物,分析其特异性,确定其最佳浓度比、最适退火温度及灵敏度,在此基础上对福建地区的柑橘样品进行检测。【结果】确定了CYVCV-F/R、CTV-F/R和HSVd-F/R等3对引物的最佳浓度比例为1∶1∶2,最适退火温度为52.9℃,灵敏度结果显示该体系可检测模板稀释到10^(-2)的阳性样品。应用该体系对采自福建部分地区的157份柑橘样品进行检测,结果发现,CYVCV、CTV和HSVd的检出率分别为47.1%、56.7%和22.9%。【结论】成功建立了柑橘CYVCV、CTV和HSVd病原的多重RT-PCR检测方法,为该类病害的检测提供准确、快速的检测方法。

猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。