南方菜豆花叶病毒(SBMV)两典型株系特异cDNA和RNA探针的制备及应用

南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）主要有２株系：菜豆株系（ＳＢＭＶ－Ｂ）和豇豆株系（ＳＢＭＶ－Ｃ），血清学方法不能予以区分。根据已报道的核酸序列设计了２对特异引物，进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆到载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中，序列测定予以证实后利用随机引物法合成放射性ｃＤＮＡ探针，再进行体外转译合成地高辛ＵＴＰ标记的ＲＮＡ探针。２种探针均可分别特异地检测Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ膜上的ＳＢＭＶ－Ｂ和ＳＢＭＶ－Ｃ。ＲＮＡ探针检测ＳＢＭＶ－Ｂ和ＳＢＭＶ－Ｃ灵敏度分别为：０．１μｇ和０．０１μｇ。

贵州南方菜豆花叶病毒的ELISA检疫

采用ELISA间接法对分布于贵州几个地区的菜豆进行南方菜豆花叶病毒的检测 ,结果表明 :在所采集到的样品中 ,仅贵阳地区的菜豆感染有南方菜豆花叶病毒。其检测的灵敏度和最佳反应稀释度分别为 80 6ng/mL和 1∶5 0 0稀释度。

MAP-H_2O_2-HRP伏安酶联免疫分析测定南方菜豆花叶病毒

提出间氨基酚 ( MAP) -H2 O2 -辣根过氧化物酶 ( HRP)伏安酶联免疫分析新体系 ,并用于南方菜豆花叶病毒 ( SBMV)的测定 .以线性扫描二阶导数伏安法检测 HRP催化 H2 O2 氧化 MAP的产物 ,用于游离 HRP及 SBMV的测定 ,灵敏度均高于经典的 ELISA显色光度法 .本法对 HRP测定的线性范围为 1 .0× 1 0 - 8～1 .0× 1 0 - 6 g/L,检测限为 3 .8× 1 0 - 9g/L;对 SBMV测定的线性范围为 4 .0～ 50 0 0 ng/m L,检测限为 4 .0ng/m L.用所建立的方法测定病毒感染病叶澄清液的最高稀释比为 1∶ 1 .5× 1 0 5 ,并与现行的 ELISA显色光度法进行对照 。

南方菜豆花叶病毒在大豆种子中的分布特点与检疫的关系

通过SPA－ELISA、免疫电镜（ISEM）和种植观察，证明南方菜豆花叶病毒（SBMV）主要存在于大豆种皮中，并能引起侵染；检疫检验时，可以通过对种皮的检验来代替对整粒种子的检验，从而达到降低检验成本，提高检验快速的目的。

大豆种传南方菜豆花叶病毒和烟草环斑病毒的GICA-RT-PCR检测

南方菜豆花叶病毒(south bean mosaic virus,SBMV)和烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,TRSV)是我国重要的进境检疫性有害生物,两种病毒均为种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究以这两种病毒的大豆病种子为试材,先用胶体金免疫层析试纸条(GICA)检测,将检测完病毒后的胶体金免疫层析试纸条上的T线和C线剪下,再用RT-PCR的方法将T线和C线上捕获的病毒直接进行扩增,这种将血清学与分子生物学相结合起来所建立的GICA-RT-PCR检测方法,省去了烦琐的总RNA提取的环节,简化了病毒检测的步骤,提高了检测的灵敏度。

普通菜豆种传病毒的分子鉴定

菜豆普通花叶病毒（BCMV）、菜豆黄花叶病毒（BYMV）和南方菜豆花叶病毒（SBMV）是黑龙江省菜豆主要的种子传播病毒。为分析菜豆种质资源携带病毒的状况,以6份普通菜豆种子的胚根、胚芽和子叶为试材,采用CTAB法提取总RNA和基因组DNA,根据BCMV、BYMV和SBMV的衣壳蛋白基因序列设计特异引物,通过PCR和RT-PCR对180份菜豆资源进行病毒检测。结果表明：RT-PCR对BCMV、BYMV和SBMV的检出率分别为12.78%、9.44%和1.67%;PCR的检出率分别为12.78%、8.33%和1.67%。所收集的6种菜豆种质资源均检出1~3种病毒,其中BCMV和BYMV是主要的病毒种类。

基于单克隆抗体的南方菜豆花叶病毒血清学检测技术

为建立南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)的快速、简便、高通量检测技术,加强该病毒的口岸检验检疫,以提纯的SBMV粒子为免疫原免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤技术获得3株杂交瘤细胞株19C3、19H9和20G4,其分泌的SBMV腹水单抗效价均达到10-7,且3个单抗与感染SBMV大豆叶片组织粗提液有强烈的特异性免疫反应,而不与感染南方豇豆花叶病毒(southern cowpea mosaic virus,SCPMV)的豇豆、健康的大豆、毛豆、豌豆、蚕豆和菜豆叶片组织粗提液发生免疫反应。以制备的单抗为核心,建立了检测植物中SBMV的ACP-ELISA和dotELISA两种血清学方法。3个单抗中19H9单抗的检测灵敏度最高,以其建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测大豆病叶粗提液的灵敏度分别达到1∶163840和1∶10240稀释浓度。利用建立的dot-ELISA方法可从上海口岸截获的大豆种子中检测出SBMV,且该检测结果得到RT-PCR方法验证。表明制备的SBMV单抗及建立的SBMV血清学检测技术可有效用于我国SBMV的口岸检验检疫。

实时荧光RT-PCR-步法检测南方菜豆花叶病毒

南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是我国二类检疫性有害生物,以南方菜豆花叶病毒日本分离物(SBMV-J)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列分析结果表明:SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成,编码266个氨基酸,SBMV-J与其它分离物及株系cp基因的核苷酸序列同源性为83%～97%,氨基酸序列同源性为86%～97%。由于SBMV各分离物及株系cp基因的同源性较低,难于设计出较长的普通PCR引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术,建立了SBMV的实时荧光RT-PCR一步检测方法。该方法的检测低限是0．16 pg,最佳检测总RNA的量是0．16 ng。

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。

逆转录交叉引物等温扩增检测南方菜豆花叶病毒方法的建立

南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)是我国进境植物检疫性病毒,可随豆类种子远距离传播。本研究针对SBMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计特异引物组,建立了一种反转录(reverse transcription,RT)交叉引物扩增(cross-priming amplification,CPA)快速检测方法,并分别结合实时荧光和侧向层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测扩增产物构建了实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD体系。结果显示,所建立的针对SBMV的RT-CPA检测方法特异性强,以其他4种可随豆类种传的植物检疫性病毒为对照,均无交叉反应。其中,实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD检测SBMV灵敏度分别达5×10^(-4)ng/μL和5 ng/μL。所建立的RT-CPA检测SBMV方法具有快速、准确、可视化等优点,在口岸检测中具有良好的应用前景。