SYBR Green I荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。

重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应

目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。

B7.1及SEA基因共转染肝癌细胞的初步研究

目的获得可表达共刺激分子B7.1和超抗原分子SEA的肝癌细胞株，检测其表达。方法用免疫组织化学方法，筛选表达B7.1及SEA的肝癌细胞阳性克隆。用流式细胞仪检测B7.1表达的阳性率，ELISA检测上清中SEA的含量。结果获得表达B7.1和SEA的肝癌细胞株，培养上清中SEA的含量达10～14×10-8g/L。结论建立了免疫细胞在肝癌细胞上的SEA和B7.1联合识别效应系统。

SEA基因与GPI信号肽序列融合基因的真核表达载体的构建和序列分析

目的 将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A (staphylococcusenterotoxinA ,SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP 1 )C末端信号肽序列 ,即糖基化磷脂酰肌醇 (glycosyl phosphatidylinositol,GPI)附着信号序列 ,拼接成融合基因 ,并构建该融合基因的真核表达载体。方法 利用基因SOEing法 ,分别扩增hPLAP 1C末端信号肽序列和SEA基因 ,然后将二段基因拼接起来 ,拼接后与pGEM T克隆载体连接 ,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3 .1 (+)中 ,测序鉴定。结果 分别成功扩增出hPLAP 1C末端信号肽序列 1 31bp和SEA基因 789bp ,并将二段基因序列成功拼接 (90 1bp) ,且成功构建了真核表达载体pcDNA3 .1 (+) /SEA GPI,经测序是正确的。结论 真核表达载体pcDNA3 .1 (+) /SEA GPI的构建 ,为研究SEA GPI抗肿瘤作用奠定了基础。

sea基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性的研究

目的构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因及其突变体原核表达系统,了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化。方法采用高保真PCR和T- A克隆法,从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的sea基因。采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体。建立sea基因及其定位突变体原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白。采用TCID_(50)法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性。采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用。结果所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100%,7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变。rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52%。rSEA对Vero细胞TCID_(50)为4.1μg,其突变体重组蛋白分别为5.8～23.5μg。1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用(P<0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似(P>0.05)。5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长(P<0.05)。结论本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统,其表达产物的细胞毒性均有所降低。由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体。

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,尤其是肠毒素。国内外由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒屡屡发生。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素仍采用传统的方法,其操作繁琐、检测时间较长,通常需要3-5 d才能完成,且灵敏度较低。本研究缩短食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测时间,针对PCR检测的灵敏性、特异性,建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法,为检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素提供了技术支持。分别采用TRIZol法和热酚法提取金黄色葡萄球菌总RNA并进行比较研究,在此基础上反转录获得cDNA,用特异引物对sea基因进行扩增,并优化PCR反应条件,获得理想的sea基因阳性扩增条带。结果表明,热酚法在总RNA提取方面优于TRIZol法,改进PCR反应时间和循环次数,最终初步建立RT-PCR检测金黄色葡萄球菌A基因的方法。

金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分型和分布

目的:建立金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测方法。初步研究生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布状况。方法:应用PCR扩增经分离鉴定的金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA-SEJ,电泳检测扩增结果。结果:建立了金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR检测方法。从生牛奶中分离的29株金黄色葡萄球菌检测到SEA-SED和SEG-SEJ基因,没有检测到SEE基因。毒素基因携带率为65.5%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占37.9%。有SEA基因的占51.7%,含其它传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占17.2%,携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI和SEJ的菌株占41.4%。结论:建立的PCR检测金黄色葡萄球菌的肠毒素基因的方法可用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型和分布的研究。研究表明,生牛奶中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,而且携带新发现的肠毒素基因的较多。

EGF-SEA融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

根据基因库中查到的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因序列和人体表皮生长因子(EGF)基因序列进行密码子优化,以适于大肠杆菌表达。人工合成SEA基因与EGF基因。将两目的基因克隆至原核表达载体pET22b中,经测序验证表明成功构建了重组表达质粒pET22b-EGF-SEA。将构建好的pET22b-EGF-SEA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达;SDS-PAGE分析表明融合基因EGF-SEA在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式得到了高效表达,产物相对分子质量约为44kDa,与理论值大小一致。包涵体经洗涤,变性、复性后用His.BindKit进行分离纯化,所得蛋白纯度≥95%。高纯度EGF-SEA融合蛋白的获得为进一步研究其生物学活性及肿瘤治疗奠定了基础。

双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤EJ细胞的杀伤作用

目的:构建由人端粒酶启动子(hTERT)和缺氧诱导因子启动子(HIF)双向调控的携带SEA基因的选择性增殖腺病毒,体外试验其对肿瘤的杀伤功能。方法:将hTERT和HIF分别酶切、连接在缺陷型腺病毒的穿梭质粒的E1A和E1B序列前,调控E1A和E1B蛋白的表达,共同转染人胚肾293细胞进行同源重组,获得双调控选择性复制性腺病毒,进行PCR鉴定。获取病毒转染膀胱肿瘤细胞EJ,MTT检测细胞存活和生长情况。结果:淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48 h,实验组肿瘤细胞明显少于对照组;MTT检测实验组在12、24、48 h活细胞数低于对照组。结论:成功构建了携带SEA基因的选择性腺病毒,且其可表达目的基因,对膀胱肿瘤细胞有一定的杀伤作用。

多重实时荧光定量聚合酶链反应检测携带耐药基因及肠毒素A基因的金黄色葡萄球菌

目的建立一种快速鉴定携带耐药基因和肠毒素A基因的金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc、甲氧西林耐药基因mecA和肠毒素A基因sea的序列,设计特异性的引物和不同荧光素标记的TaqMan探针,通过反应体系和反应条件的优化,建立了能同时检测鉴定耐甲氧西林和产肠毒素A的金黄色葡萄球菌的多重荧光PCR方法。结果该方法特异性好,可在同一个PCR反应体系中同时检测金黄色葡萄球菌的3种基因成分,检测效率高。灵敏度可以达到2×10-7μg/μl。结论该方法可用于食品样品的检测和流行病学分离株的快速鉴定。

重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染入B16黑素瘤细胞中的表达情况。方法用RT-PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达。结果在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h开始有SEA蛋白的表达,到72h表达量达最高值87.22,之后减弱,直到168h仍有少许表达。结论SEA基因可以在B16黑素瘤细胞中表达,为下一步黑素瘤的基因治疗奠定基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达

目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。

基于TaqMan探针荧光定量PCR技术快速检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因序列分析、对比,设计特异性引物和Taq Man探针,建立对金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测方法,并验证该方法的特异性、稳定性和灵敏性。结果:Taq Man探针荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A具有极强特异性,标准曲线相关系数为0.998,最低可检测出71个拷贝数的细菌DNA,检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A菌灵敏度为1.3×102CFU/m L,不同浓度质粒重复性扩增试验Ct值的变异系数均<3%,显示了良好重复性。结论:Taq Man探针荧光定量PCR方法可以在6h内快速、准确地检出金黄色葡萄球菌肠毒素A,为金黄色葡萄球菌快速检测和食物中毒快速诊断提供技术支撑,推动了荧光PCR技术在食品安全检测方面的实践应用。