沉默JP2基因对小鼠心肌细胞SK2通道的影响

目的:探讨心肌细胞JP2与SK2通道的相互作用。方法:构建靶向小鼠JP2基因的siRNA慢病毒载体(LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2),将其转染至小鼠心肌细胞,以转染空载体(LV-NC-EGFP)和未转染细胞(CtrlNC)作对照。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组心肌细胞JP2 mRNA和SK2蛋白的表达。结果:转染48 h后,各组小鼠心肌细胞JP2 mRNA表达的差异有统计学意义(F=31.775,P<0.001),LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2组较Ctrl-NC及LV-NC-EGFP组细胞降低。小鼠心肌细胞感染LV-JP2-RNAi-2 72 h后,SK2通道蛋白表达被抑制。结论:沉默小鼠心肌细胞JP2基因可抑制SK2通道的功能。

小电导钙激活钾通道SK2在容量超负荷心力衰竭大鼠窦房结表达的改变

目的观察小电导钙激活钾通道SK2通道在心力衰竭(HF)大鼠窦房结组织中表达的改变。方法以腹主动脉-下腔静脉穿刺造瘘术建立容量超负荷心力衰竭大鼠模型(n=7),假手术对照组(SO)大鼠切开腹腔,穿刺腹主动脉,但不造成腹主动脉-下腔静脉之间的瘘(n=7)。于术后8周通过超声心动图测定左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左心室舒张末内径(left ventrieular end-diastolic diameter,LVEDd),并于取材时测定心脏质量/体质量(heart weight/body weight),评价心脏结构与功能改变。分离大鼠窦房结细胞以免疫荧光染色法观察SK2通道蛋白的表达,同时取材窦房结组织,提取组织蛋白,行Western blot测定比较心衰大鼠窦房结组织SK2通道表达的改变情况。结果超声心动图结果显示,心力衰竭大鼠心脏收缩功能与舒张功能明显减低[LVEDd(mm):SO 5.91±0.36 vs HF 11.15±0.91,P<0.01;LVEDs(mm):SO 2.89±0.28 vs HF 7.89±0.70,P<0.01;LVEF(%):SO 87.10±1.63 vs HF 62.10±2.57,P<0.01;LVFS(%):SO51.27±2.03 vs HF 30.05±1.66,P<0.01],心脏质量/体质量明显增大(SO 244.19±36.87 vs HF 593.21±28.72,P<0.01)。单细胞免疫荧光染色结果示SK2通道表达于两组大鼠窦房结细胞膜上,Western blot定量分析结果示心力衰竭组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白表达水平较假手术组明显减低(0.22±0.10 vs 0.31±0.16,P<0.05)。结论 SK2通道在心力衰竭大鼠窦房结组织中表达明显下调。

大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位

目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用。方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞的定位。结果:心肌细胞H9c2表达SK2通道及JP2蛋白,SK2通道和JP2蛋白可形成免疫复合物,SK2通道和JP2蛋白存在部分共定位。结论:心肌细胞H9c2中SK2通道与JP2蛋白存在相互作用。

高血压大鼠心肌2型小电导-Ca2+-激活-K+通道蛋白（SK2）表达的变化

目的:观察高血压大鼠心肌细胞2型小电导-Ca^2+-激活-K^+(SK2)通道蛋白表达情况。方法:12只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组(5只)和实验组(7只),实验组采用N’-硝基-L-精氨酸(L-NNA 15 mg/(kg·d))腹腔注射制备高血压模型,对照组以等体积生理盐水腹腔注射,每天称量大鼠体重,每周测量血压及心电图变化,4周后处死大鼠取心脏;采用Western blot的方法检测心肌SK2通道蛋白表达水平。结果:给药4周后,与对照组相比,实验组大鼠血压明显升高(P<0.05),心电图QRS时长和R-R间期延长,实验组大鼠心房组织和心室组织SK2通道的表达均明显升高(1.12±0.18 vs 0.52±0.99,1.64±0.26 vs 0.99±0.22,P<0.05)。结论:高血压模型大鼠心房和心室SK2通道表达增加,其可能是导致高血压模型大鼠出现心律失常的机制之一,为高血压疾病的治疗和预后提供新的思路和策略。

小电导钙激活型钾通道SK3在大鼠偏头痛模型中脑干的表达变化

目的初步探讨小电导钙激活型钾通道SK3与大鼠偏头痛的关系,为研究偏头痛的发病机制,寻找新治疗靶点提供实验依据。方法 40只成年雌性SD大鼠随机分为对照组8只,模型组16只,干预组16只,后两组再随机分为发作期组和间歇期组,每组8只。按Tassorelli Cristina法复制偏头痛大鼠模型。对照组用生理盐水造模。干预组每天灌服氟桂利嗪2 ml(0.5 mg/kg),对照组每天灌服生理盐水2 ml。发作期组于第5次造模后3 h、间歇期组于第5次造模后4 d断头处死取脑干组织。RT-PCR法及Western法分别检测各组脑干SK3 mRNA及其蛋白的表达。结果模型组、干预组脑干SK3 mRNA及其蛋白的表达水平均较对照组下降(P<0.05),且各发作期组均较相应间歇期组更低(P<0.05);而模型发作期组与干预发作期组、模型间歇期组与干预间歇期组比较SK3 mRNA及其蛋白的表达水平无明显差异(P>0.05)。结论脑干SK3表达的降低可能与偏头痛的发生发展有关;氟桂利嗪防治偏头痛可能不是通过影响脑干SK3的表达量实现的。

神经对大鼠骨骼肌小电导钙激活钾通道(SK3)表达的影响

目的小电导钙激活的钾通道(SK3)介导了动作电位后的后超极化电位的产生,在调节可兴奋细胞的膜电位中起关键作用。使去神经支配和肌强直营养不良患者骨骼肌SK3表达显著上调。本实验拟观察神经对骨骼肌SK3钾通道表达的调节作用。方法在Wistar大鼠,分别通过切断坐骨神经和局部注射河豚毒素(TTX)建立比目鱼肌去神经支配模型,和通过钳夹损伤比目鱼肌神经建立比目鱼肌去神经后神经再支配模型。在体给予去神经比目鱼肌频率为30Hz的电刺激(100脉冲/100 s)。实验结束后,免疫荧光法测定比目鱼肌中SK3钾通道的表达和定位;提取比目鱼肌组织总mRNA和蛋白,逆转录PCR和Western Blot分别检测SK3 mRNA和蛋白水平。结果切断坐骨神经能显著上调比目鱼肌SK3 mRNA和蛋白表达,且分别在术后第6 d和第9 d到达稳定。TTX诱导肌肉瘫痪也能显著上调比目鱼肌SK3 mRNA和蛋白表达。钳夹比目鱼肌神经所造成的暂时神经损伤能诱导SK3蛋白表达上调,而随着神经功能的恢复SK3蛋白表达也随之显著下调。在切断除坐骨神经术后6 d,在体给予电刺激6 d能显著下调比目鱼肌SK3的高表达;而且,在去除坐骨神经的同时给予电刺激则能阻止比目鱼肌SK3表达的上调。结论神经对骨骼肌SK3钾通道表达具有抑制作用,其作用与唤起肌肉活性密切相关。在体电刺激能抑制和防止去神经诱导的骨骼肌SK3蛋白表达上调,可能是改善神经损伤后或相关疾病所致的肌强直症状的有效手段之一。

激活脊髓小电导钙离子激活钾通道可抑制小鼠吗啡痛觉过敏

目的探究脊髓小电导钙离子激活钾通道(small conductance Ca^(2+)-activated K^+channels,SK通道)激活后对小鼠吗啡所致痛觉过敏的影响。方法选用♂C57BL6/N小鼠,建立吗啡痛觉过敏模型,鞘内注射SK通道激活剂1-EBIO后,测量小鼠热甩尾潜伏期(tail withdrawal latency,TWL),机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和内脏痛阈的变化。结果吗啡痛觉过敏模型小鼠与生理盐水对照组小鼠相比,热甩尾潜伏期、机械缩足阈值和内脏痛阈均降低;而鞘内注射SK通道激活剂1-EBIO后,与给药前相比,小鼠的痛阈热甩尾潜伏期,机械缩足阈值和内脏痛阈均升高;吗啡模型组小鼠的脊髓SK2膜蛋白表达量较对照组明显降低,而给予1-EBIO后,脊髓SK2膜蛋白表达量较模型组明显升高。结论脊髓SK通道参与小鼠吗啡引起的痛觉过敏。

慢性心衰大鼠心肌2型小电导-Ca^(2+)-激活K^+通道及Junctophilin 2表达的改变

目的:检测慢性心力衰竭模型大鼠心肌细胞膜2型小电导-Ca^(2+)-激活K^+(SK2)通道和Junctophilin 2(JP2)蛋白表达的变化,为人类心力衰竭机制的研究和针对性的治疗提供新思路。方法:10只健康成年SD大鼠随机分为假手术组(5只)和手术组(5只),手术组采用腹主动脉缩窄的方法制备慢性心衰模型,假手术组大鼠分离腹主动脉后不进行缩窄术。每周观察各组大鼠心电图的变化,称量大鼠的体重,之后杀死大鼠取心脏和肺称重,计算心脏重量指数和肺系数;提取心脏组织蛋白,用Western blot的方法检测心肌SK2通道和JP2蛋白的表达水平。结果:术后第8周,手术组大鼠心电图ST段抬高或T波高耸;并且与假手术组相比,手术组大鼠心脏重量指数和肺系数均显著增加;心肌组织SK2通道的表达显著增加,JP2表达下降(P均<0.05)。结论:慢性心衰模型大鼠心肌JP2蛋白表达减小,SK2通道表达增加。

SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建SK2和JPH2双基因重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2,并检测其在转染后HEK293细胞中的表达。方法:以p CMV6-entry/SK2为模板,PCR扩增出SK2片段,通过BgⅢ/HindⅢ酶切位点克隆入真核表达载体p IRES-EGFP,将JPH2序列插入构建的SK2表达载体p IRES-EGFP-SK2,并通过酶切及测序鉴定。脂质体转染法将重组质粒p IRES-EGFP/SK2+JPH2转染HEK293细胞,采用Western blot法检测SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达。结果:构建的重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2经酶切和测序鉴定,证实插入的序列与Gen Bank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。p IRES-EGFP/SK2+JPH2质粒转染HEK293细胞48 h后,SK2和JPH2蛋白均能成功表达。结论:成功构建了重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2。

SK3钾通道通过PI3K/Akt-ERK通路介导Cu^(2+)-Aβ复合物所致小胶质细胞激活

目的:探讨Ca2+激活的小电导SK3钾通道在Cu^(2+)-Aβ复合物(Cu-Aβ)所致小胶质细胞激活中的作用及下游信号通路。方法:应用Cu-Aβ激活BV2小胶质细胞,采用ELISA和Amplex Red试剂盒检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和过氧化氢(H2O2)的含量,应用qPCR和Western blot检测钾通道m RNA和蛋白水平及相关信号通路蛋白的磷酸化。结果:(1)应用不同离子通道阻断剂以及不同亚型钾通道阻断剂预处理的实验结果表明,SK3通道可能介导了Cu-Aβ所致的小胶质细胞激活。(2)qPCR和Western blot检测结果表明,Cu-Aβ可上调小胶质细胞内SK3 m RNA和蛋白表达。(3)通过转染SK3-siRNA下调小胶质细胞内SK3表达水平,结果表明,下调SK3表达后显著抑制Cu-Aβ所致的小胶质细胞激活。(4)应用特异性信号分子阻断剂预处理的实验结果表明,PI3K/Akt信号和ERK信号均参与了Cu-Aβ所致的小胶质细胞激活。(5)应用相关信号分子阻断剂预处理的实验结果进一步表明,在介导Cu-Aβ诱发的小胶质细胞激活过程中,SK3通道位于PI3K/Akt-ERK信号通路的上游。结论:SK3通道通过其下游的PI3K/Akt-ERK信号通路介导Cu-Aβ所致的小胶质细胞炎症反应。

Synaptobrevin-2促进心房肌SK2通道转运的机制研究

小电导钙激活钾通道亚型2(SK2通道)主要在心房表达,与心房颤动有关.高频刺激模拟心房快速起搏可以增加SK2电流,但是其中的机制并不完全清楚.本研究旨在研究转运调节蛋白Synaptobrevin-2(VAMP2)在调节心房肌细胞膜SK2通道转运过程中的作用.以培养的新生大鼠(Rattus norvegicus)心房肌细胞(NRAMs)和表达有SK2通道的HEK293细胞为研究对象,采用蛋白质印迹、膜片钳、共聚焦显微成像、流式细胞术和全内荧光反射等技术研究VAMP2对SK2通道转运的影响.结果发现,快速起搏可上调VAMP2蛋白和增加SK2通道蛋白在细胞膜上的表达,而敲低VAMP2可降低NRAMs细胞膜上SK2通道蛋白的表达.在HEK293细胞上共表达VAMP2和SK2,增加了SK2的表达,加速了SK2向细胞膜的转运,并通过抑制SK2内吞来稳定SK2通道蛋白在细胞膜上表达.由以上结果可知,VAMP2可能通过促进SK2通道的表达,转运和稳定细胞膜上的表达,参与快速起搏心房肌细胞SK2功能的增强.

小电导钙激活钾离子通道对心房颤动的影响

小电导钙激活钾离子(SK)通道是非电压依赖性的钾离子通道,细胞内钙离子可激活SK通道。由于SK通道主要表达在心房肌细胞中,且研究表明心房颤动(简称房颤)的发生与SK通道有关,SK通道抑制剂对房颤有潜在治疗作用,SK通道可能是房颤治疗的潜在靶点。

前庭代偿中双侧前庭内侧核对输入刺激响应的敏感性变化及其离子机制

前庭代偿是研究前庭疾病防治策略和成年后由外周损伤导致的中枢神经系统可塑性的重要模型。脑干中的前庭内侧核(medial vestibular nucleus, MVN)是实现前庭代偿的重要中枢。MVN神经元的兴奋性和敏感性对前庭功能的正常执行十分关键,但先前的研究集中关注于单侧外周迷路切除(unilateral labyrinthectomy, UL)这一前庭代偿模型中患侧MVN中神经元兴奋性活动的变化,对双侧MVN神经元动态响应输入刺激的敏感性变化仍知之甚少。本研究采用实时荧光定量PCR、离体脑片全细胞膜片钳记录和行为学方法,观察到UL后6 h,大鼠表现出显著的自发运动障碍,且其患侧而非健侧MVN中B型神经元的兴奋性活动显著降低。但与之相反,健侧而非患侧MVN中的B型神经元对斜坡和阶跃电流刺激的敏感性则显著升高。UL后1周,大鼠基础运动行为得到代偿,其患侧MVN神经元的兴奋性和健侧MVN神经元的敏感性均恢复至正常水平。此外,参与B型MVN神经元敏感性调控的小电导钙激活钾通道(small conductance Ca^(2+)-activated K^(+)channel, SK) UL后6 h在健侧MVN中选择性表达下调,而1周后恢复至正常水平。药理学选择性阻断健侧MVN中的SK通道以抑制其UL后的功能可塑性变化,可显著延迟前庭运动障碍的代偿。本研究结果提示,患侧MVN神经元兴奋性与健侧MVN神经元敏感性的可塑性变化可能共同参与了前庭症状的产生和前庭代偿,而SK通道可能是介导健侧MVN神经元敏感性随前庭代偿动态变化的重要离子机制。

apamin对日龄雏鸡长时记忆的影响

日龄雏鸡的一次性被动回避学习任务模型被广泛应用于记忆机制研究,具有多方面的优势和便利性.apamin是SK通道(钙离子激活的小电导钾离子通道)的一种选择性阻断剂,以往研究显示其可能增进记忆.但人们对其作用机制的了解不是很充分.使用颅内微量注射方法,在雏鸡中枢记忆相关核团IMM施加apamin,研究其对记忆形成和保持的影响.实验结果显示,雏鸡在弱刺激条件下的被动回避任务中本不能形成稳定的长时记忆,但在训练前短时间内或训练后立即注射适量apamin,可以易化长时记忆的形成.然而,apamin对记忆随时间衰退的过程几乎没有影响,即对记忆保持没有增进作用.此外,在左、右脑IMM单侧注射apamin都可促进记忆形成,但所需剂量高于双侧注射时,且在左侧产生效应的时间早于右侧,这体现了两侧IMM在记忆加工中作用的不对称性.这些结果提示,apamin可能通过阻断中枢记忆相关核团内的SK通道,影响由训练诱发的、与记忆形成有关的某些分子或细胞事件,在一定程度上起到改善记忆的作用.