采用SMRT测序技术考察莲子的真菌群落多样性

目的 考察莲子中真菌群落的多样性。方法 采用单分子实时(SMRT)测序技术对莲子(红莲和白莲)中真菌的ITS全长扩增片段进行测序分析。通过评估测序数据、分析其α和β多样性,剖析真菌的组成、考察组间差异及菌属间的相关关系,剖析莲子的真菌群落结构。结果 共检测到1界、10门、30纲、75目、158科、247属和342种真菌,优势菌为Botryosphaeria wangensis(0~79.57%)、Lasiodiplodia laeliocattleyae(0.32%~49.18%)和Colletotrichum aenigma(0~31.76%)和Wallemia canadensis(0~22.86%)。有潜在致病风险的真菌为Colletotrichum aenigma、Aspergillus vitricola、Rhizomucor pusillus,存在产毒风险的真菌为Fusarium pernambucanum。红莲和白莲样品的真菌组成在组间存在显著性差异,差异菌主要是Botryosphaeria wangensis和Wallemia canadensis。结论 SMRT测序技术对研究莲子中真菌的多样性具有较好的适用性,并可通过分析产毒真菌的种类为莲子的安全使用提供风险预警。

基于PacBio SMRT测序技术评估妊娠期糖尿病人的肠道菌群

【目的】肠道菌群是位于人体肠道内的微生物菌群,其组成与人类多种疾病相关。例如,已有研究表明肠道菌群的变化与妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)的发病密切相关。因此本研究基于PacBio SMRT测序技术评估及比较了不同民族(汉族和蒙族)及是否患GDM的孕妇的肠道菌群。【方法】本研究利用PacBio SMRT测序技术对97例患有GDM及健康的汉族和蒙族孕妇粪便样本进行了全长16S rRNA测序及分析。【结果】总体来说,处于相同孕期的4组孕妇肠道菌群的组成相似,不同核心菌群展现出不同强弱的相关性。本研究在种的水平上共鉴定到了44个种。在汉族人中,患有妊娠期糖尿病的孕妇肠道菌群中Akkermansia muciniphila菌的相对丰度要显著低于健康孕妇;而在蒙族人中,健康孕妇与GDM孕妇间差异并不明显。在健康对照中发现汉族孕妇肠道菌群中Bacteroides uniformis菌的相对丰度显著高于蒙族孕妇;但在患有GDM组中未找到不同民族分组间的差异。另外,功能预测结果发现四组样本菌群功能组成高度相似,大多数功能基因都与能量代谢有关。汉族GDM患者与健康对照组间没有发现显著差异,但在蒙族GDM患者中发现无机离子运输等功能相对丰度显著高于与蒙族正常孕妇。【结论】在相同的孕期,妊娠期孕妇的核心肠道菌群结构与功能是相对稳定的,而民族差异也不会对妊娠期菌群产生显著性影响。但在四组间可以检测到一些低丰度的差异菌群,如Akkermansia muciniphila,其丰度的变化可能导致了肠道中一些与肠道营养吸收等有关的代谢发生变化,而这些变化可能与妊娠期糖尿病的发生密切相关。本研究将有助于探究肠道菌群在GDM发病机制中的作用。

基于纯培养方法和PacBio三代测序技术研究蒙古国传统酸马奶中乳酸菌多样性

通过纯培养方法结合PacBio三代测序技术对采自蒙古国的12份传统酸马奶中的乳酸菌多样性进行研究。应用传统的纯培养技术从12份传统酸马奶样品中分离出62株乳酸菌,通过16S rRNA基因序列分析和系统进化关系研究,62株乳酸菌被鉴定为5个属,6个种,分别是:25株瑞士乳杆菌、20株植物乳杆菌、7株产马乳酒乳杆菌、5株屎肠球菌、3株嗜热链球菌和2株粪肠球菌。采用PacBio SMRT测序技术研究其中8份样品中乳酸菌的多样性,宏基因组测序得到的优势菌为乳酸菌,同时也检测到一些痕量的其它种属细菌。共检测到5个乳酸菌的属,分别是:乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、明串珠菌属和肠球菌属,20个乳酸菌的种,即:瑞士乳杆菌、乳酸乳球菌、副乳链球菌、棉子糖乳球菌、肠膜阴串珠球菌和产马乳酒乳杆菌。宏基因组测序相对含量表明:蒙古国酸马奶样品中乳酸菌优势属为乳杆菌属(95.56%),优势种为瑞士乳杆菌(94.64%),纯培养方法和宏基因组三代测序方法都表明瑞士乳杆菌为蒙古国传统酸马奶中的优势菌种。宏基因组测序技术除检测到纯培养获得的菌株外,还获得14个低丰度乳酸菌,如棉籽糖乳球菌、肠膜明串珠球菌和开菲尔乳杆菌等,这些菌在酸马奶中含量较少。通过PacBio SMRT测序技术可以全面了解酸马奶中乳酸菌的多样性,为通过纯培养方法获得低丰度乳酸菌提供指导。

DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价

目的评估不同DNA聚合酶是否会对以16SrRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响。方法用美国太平洋公司的三代测序仪(PacBio single molecule real-time sequencing technology)对3份分别采用KAPA HiFi^(TM) HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至"种"水平的测序分析。结果经配对Mann-Whitney U检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义(P>0.05),然而在某些相对含量较少的操作分类单元(OTU)上,其扩增效率存在差异。经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 KAPA HiFi^(TM) HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PacBio SMRT测序结果。

单分子实时测序技术在环境微生物研究中的应用

1975年,第一个cDNA的基因组--噬菌体фX174基因组的测序完成,标志着测序时代的开始。1996年以来人类基因组计划的发起极大地推动了测序技术的应用和发展,第二代测序技术也被称为高通量测序技术。而单分子DNA测序技术是最近10年内发展起来的新一代的测序技术,称为第三代测序技术,其中包括单分子实时测序(Single molecule real time sequencing,SMRT)、真正单分子测序和单分子纳米孔测序等技术。SMRT测序技术有超长读长、测序周期短、不需要模板扩增和直接检测表观修饰位点等特点,为研究人员提供了新的选择。本文综述了SMRT测序技术的基本原理、性能以及它在微生物16S rRNA基因、微生物全基因组以及微生物宏基因组测序等方面的应用,并分析了SMRT测序技术在环境微生物应用中的优势以及存在的问题。

摩洛哥自然发酵驼乳中乳酸菌分离鉴定及特性研究

为了丰富菌种资源库资源,探索乳品细菌多样性及菌株生化特性,对摩洛哥阿尤恩地区4份自然发酵驼乳的乳酸菌应用传统纯培养方法和宏基因组16S rRNA基因测序技术进行分离、鉴定,同时对细菌宏基因组测序进行多样性研究及单菌株生化特性研究。由纯培养结果可知:4份样品中分离乳酸菌株包含3个属、8个种,共82株乳酸菌,其中58.54%为Lactococcus lactis;根据宏基因组测序结果可知:4份样品中分离的细菌分属于7个门、78个属和147个种,Proteobacteria(54.64%)和Firmicutes(41.77%)是样品中的优势菌门,Lactococcus(31.87%)及Lactococcus lactis(22.95%)占比较高,是样品中优势菌属及菌种。通过比较不同乳酸菌在相同环境下的生长情况及产酸速率,从样品中分离得到的48株Lactococcus lactis中筛选得到2株生长快、产酸速率高的菌株IMAU98054和IMAU98084。2株菌最适生长温度为37℃,pH值为5.5~7.5,且有一定的盐耐受性,NaCl质量分数小于6%时生长不会受到明显抑制。2种菌株在37℃发酵18 h后其OD600可达到2.5218和2.5172。研究结果表明:摩洛哥阿尤恩地区自然发酵驼乳中包含多类细菌,Lactococcus lactis是其中的优势菌种,并从其中筛选出2株生长快、产酸速率高的菌株IMAU98054和IMAU98084。

新疆自然发酵酸牛乳连续发酵期间乳酸菌菌群动态变化

为了阐明自然发酵酸牛乳长期连续发酵过程中乳酸菌菌群结构动态变化,为其工业化生产提供参考依据,该研究对3份新疆自然发酵酸牛乳样品进行实验室连续发酵9个月,利用纯培养方法及PacBio SMRT测序技术研究酸牛乳样品中乳酸菌多样性。结果表明,随着连续发酵,酸牛乳中微生物群落产酸能力增强,乳酸菌活菌数下降,最终维持在7.0 lgCFU/mL以上。此外,乳酸菌菌群结构不稳定,Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis、Streptococcus salivarius等菌种减少或消失,而Lactobacillus helveticus、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gallinarum、Enterococcus durans含量增加。将自然发酵酸牛乳中混合菌种直接用于酸牛乳工业化生产尚需更多的研究支撑,从自然发酵乳中筛选发酵特性优良的乳酸菌,确定最佳发酵菌种组合,对酸牛乳工业化生产具有重要意义。

孤独症谱系障碍儿童的唾液微生物群落研究

目的:通过宏基因组学方法结合Pacbio SMRT高通量测序技术探究孤独症谱系障碍(ASD)儿童中口腔健康和罹患龋齿者的唾液微生物菌群的组成及其差异。方法:收集42名ASD儿童唾液样本,其中无龋组22名,高龋组20名,提取DNA进行聚合酶链式反应扩增,利用PacBio SMRT高通量测序技术对16S rRNA全长进行测序,进行口腔菌群结构和组成的分析比较。结果:两组间唾液菌群结构差异有统计学意义(P<0.05),且高龋组的菌落结构更为相似和保守(P<0.05)。在种水平上,无龋组高表达有伯杰氏杆菌、南锡普氏菌、金黄色葡萄球菌三个健康相关微生物(P<0.05),高龋组高表达有变形链球菌、口普氏菌、浑浊戴阿利斯特杆菌、具核梭杆菌四个龋病相关微生物(P<0.05)。结论:ASD儿童的龋齿唾液菌群有整体菌群结构和特定物种组成的改变,为ASD儿童的龋齿预防和诊断提供新策略。

内蒙古传统发酵驼乳中乳酸菌和酵母菌的分离鉴定及其生物多样性分析

采用传统培养方法对4份内蒙古阿拉善盟传统发酵驼乳样品中的乳酸菌和酵母菌进行分离纯化,运用16S rRNA基因序列分析方法进行种属鉴定,同时采用Pac Bio SMRT三代测序技术对样品中的细菌和真菌多样性进行研究。发酵驼乳中共分离到8株乳酸菌和5株酵母菌,乳酸菌包括1株胚芽乳杆菌、2株瑞士乳杆菌、2株嗜热链球菌、2株假肠膜明串珠菌和1株开菲尔基质乳杆菌。酵母菌包括1株马克斯克鲁维酵母、2株酿酒酵母、1株诞沫假丝酵母和1株芽殖酵母。Pac Bio SMRT测序结果显示,硬壁菌门为4份发酵驼乳样品中的优势细菌门,乳杆菌属为优势细菌属,以及瑞士乳杆菌为优势细菌种;子囊菌门为发酵驼乳样品中的优势真菌门,克鲁维酵母菌属为优势真菌属以及马克斯克鲁维酵母为优势真菌种。