猪SMYD3基因的克隆、序列分析及其对猪成纤维细胞增殖的影响

试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P<0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P<0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。

shRNA干扰SMYD3对肝癌细胞c-Myc表达及凋亡的影响

目的:观察SMYD3(SET and MYND-domain containing3)基因沉默后c-Myc的表达及对HepG2细胞凋亡的影响.方法:构建针对SMYD3的shRNA干扰质粒Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2和阴性对照质粒Pgenesil-1-hk,同时设空白对照组,采用Lipofectamine2000脂质体介导转染法转染质粒.转染后24、48、72h,RT-PCR检测HepG2细胞SMYD3和c-Myc的表达情况.流式细胞术法检测各组细胞的凋亡.结果:SMYD3、c-Myc基因在HepG2细胞中强表达.RT-PCR显示Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2转染组与阴性对照质粒转染组Pgenesil-1-hk转染24、48、72h后相比,SMYD3基因表达均明显受到抑制(F=67.46,P<0.01;F=176.79,P<0.01;F=175.28,P<0.01),同时c-Myc表达下调(三组之间:F=11.58,P=0.009;F=126.41,P<0.01;F=261.25,P<0.01).Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2转染组细胞早期凋亡率与Pgenesil-1-hk转染组(LSD-t=-13.58,-12.62,均P<0.01)、空白组(LSD-t=-18.62,-17.67,均P<0.01)相比有显著性差异.结论:RNA干扰技术特异性沉默HepG2细胞SMYD3基因后,抑制了c-Myc的表达,促进了HepG2细胞的凋亡.

SMYD3调控人乳腺癌MCF-7细胞增殖机制的研究

目的:通过转染技术抑制或增强SMYD3基因的表达,以探讨SMYD3对乳腺癌MCF-7细胞增殖的调控机制机制。方法:以MTT法和软琼脂克隆形成实验研究抑制或增强SMYD3基因表达对细胞增殖的影响,以RT-PCR法和Western印迹法检测MCF-7细胞经转染后,胞内SMYD3、ERK/MAPK通路相关蛋白及其磷酸化产物,以及凋亡和细胞周期调控相关蛋白表达水平的变化。结果:用针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒转染MCF-7细胞后,其SMYD3基因mRNA和蛋白表达水平下调,细胞生长受到抑制,细胞中ERK1/2、CyclinD1和CDK4蛋白水平明显下调;软琼脂克隆形成实验显示,增强SMYD3基因表达能明显促进MCF-7细胞克隆形成。结论:SMYD3可通过激活ERK/MAPK信号转导通路和上调细胞周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的水平提高肿瘤细胞的增殖能力。