薄壳山核桃SSR-PCR体系优化及引物筛选

【目的】为建立薄壳山核桃SSR-PCR的最佳反应体系,筛选薄壳山核桃高多态性SSR引物,为薄壳山核桃构建指纹图谱、亲缘关系分析、品种鉴定等后续的相关研究提供有力工具。【方法】采用单因素试验与L_(16)(4^(5))正交试验设计相结合的方法,以薄壳山核桃DNA作为模板,对影响薄壳山核桃SSR-PCR反应体系中的6个影响因素(DNA、Mg^(2+)、10×PCR Buffer、引物、Taq酶、dNTPs)进行单因素试验,根据单因素试验的结果确定各影响因素的适宜用量范围,再据此设计正交试验。【结果】根据正交试验扩增结果,确立薄壳山核桃的最佳反应体系(10μL)为:Taq酶0.15 U,Mg^(2+)2.0 mmol/L,dNTPs 0.1 mmol/L,引物1.0μmol/L,50 ng模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,ddH_(2)O5.8μL。5个因素影响薄壳山核桃SSR-PCR反应体系的扩增效果,其影响程度大小依次为Taq酶>引物=DNA>Mg^(2+)>dNTPs。以8种薄壳山核桃DNA为模板,4对薄壳山核桃引物对优化后的薄壳山核桃SSR-PCR反应体系进行验证,均扩增出明亮清晰的条带,证明优化后的反应体系稳定可靠。利用优化后的反应体系在283对核桃及山核桃引物中筛选出高多态性薄壳山核桃引物12对,其多态性位点信息数均高于0.5。【结论】优化后的反应体系及筛选出的12对薄壳山核桃引物可直接用于后续的SSR分子标记试验,为薄壳山核桃亲缘关系鉴定、交配系统分析等研究奠定理论基础。

芦笋SSR-PCR反应体系的优化及验证

以芦笋幼叶为材料,采用单因素与L1(643)正交试验相结合的方法,对影响芦笋SSR-PCR反应的3个因素(2×Taq Master Mix,模板DNA,引物)进行优化,并以此为基础通过退火温度和循环次数试验筛选引物最佳退火温度和循环次数。结果表明,芦笋基因组DNA的SSR-PCR最优反应体系为:10μL反应体系中,50 ng·μL^(-1) DNA模板0.125μL,10μmol·L^(-1)上下游引物各0.5μL,2×Taq PCR Mix 3μL,灭菌ddH2O 5.875μL。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸35 s,循环25次;72℃延伸10 min,4℃保存。经5对引物组合和5个不同芦笋品种DNA扩增验证,该体系稳定可靠,可用于芦笋遗传多样性分析、种子纯度鉴定、分子标记辅助育种及重要农艺性状的图位克隆等工作。

木本油料植物无患子SSR特征分析及SSR-PCR反应体系构建

无患子(Sapindus saponaria L.)是集生物柴油、药用、生态等多种用途于一体的经济型木本油料。本研究利用MISA软件挖掘了无患子叶片转录组中的SSR,对搜索到的SSR进行了特征分析,构建并优化了无患子SSR-PCR反应体系。结果表明,无患子叶片转录组共有Unigene条数目为52460条,其中含有SSR的Unigene有7014条,共检索到8654个SSR。经统计,SSR丰富度从二至六核苷酸依次减少,依次有4327、2669、634、208、161个。SSR长度范围在12~250 bp之间,长度小于等于15 bp的有3619个,均为二和三核苷酸;长度大于15 bp的有5035个,以二、三核苷酸居多。所有SSR共有435种不同重复单元。SSR不同类型重复基元频次分布在4~30次之间,主要分布在4~10频次,共有7090个SSR位点,占总频次的89.65%。SSR位点靶基因GO功能注释显示,无患子叶片转录组Unigene可分为3大类别51个小组;KEGG功能注释显示5大类别中,代谢通路占比最高为65.18%。通过对无患子SSR-PCR反应体系构建与优化,无患子SSR-PCR反应体系最佳组合为:循环次数37次、退火温度60℃、引物量2.0μL、DNA模板浓度为40 ng/μL。

苦楝SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]借鉴以往楝属文献报道的SSR引物,筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝SSR引物,为苦楝遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础。[方法]本研究采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选。[结果]苦楝SSR-PCR最优反应体系为:1.0μL 50 ng·μL^(-1)模板DNA,1.2μL 100μmol·L^(-1)引物,1.0μL 10 mmol·L^(-1)d NTPs,0.8μL 25 mmol·L^(-1)Mg^(2+),0.15μL 5 U·μL^(-1)Taq酶,1.5μL 10×Buffer,补dd H2O至15μL;最终筛选出15对具有高度多态性、稳定性高、重复性好的SSR引物。[结论]本研究成功优化了苦楝SSR-PCR反应体系,并成功筛选出15对适用于苦楝的SSR引物。

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16（44）正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序。在15μL体系中各反应的最适合含量为：50ng模板DNA,240μmol/LdNTP,0.4μmol/LSSR引物,1.0UTaqDNA聚合酶,1.5μL10×PCRBuffer,2.5mmol/LMgCl2。PCR适宜扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸1min,共35个循环,72℃延伸10min,4℃保存。并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃。同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对。用于鸭茅SSR标记的进一步研究。

8种柱花草属牧草SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

柱花草(Stylosanthes)是优良的豆科牧草,叶片中含有大量的多糖多酚,本研究利用改良CTAB法抽提柱花草叶片中总DNA。通过正交试验设计L16(45),确立了柱花草SSR-PCR最佳反应体系:20μL体系中1μL 50ng·μL-1模板DNA,1.6μL 5μmol·L-1引物,1.6μL 10mol·L-1dNTPs,1.2μL 25mol·L-1 Mg2+,0.3μL 5U·μL-1 Taq聚合酶,2μL 10×PCR Buffer(Mg2+free),剩余用ddH2O补足。扩增反应程序为94℃变性40s,Tm(不同退火温度)退火时间40s,72℃延伸45s,循环数35个。利用优化体系对来自7种柱花草的123对SSR引物在8个不同种柱花草中进行转移,共筛选出44对引物在8种柱花草中都能有效扩增,并从中筛选出26对在8个不同种柱花草中富含多态性引物,为今后利用SSR标记对柱花草属的指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定与保护等工作提供重要依据。

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的 对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法 采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果 T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论 中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3。

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。

利用正交设计优化黄瓜的SSR-PCR反应体系

以白皮黄瓜B-2-2为试材,采用正交设计L16（45）在4个水平上对影响黄瓜SSR-PCR反应体系的Taq酶浓度、Mg^2＋含量、模板DNA用量、dNTP浓度及引物用量等5个因素进行了试验优化,并用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平,建立了黄瓜SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明：在20μL反应体系中,Taq酶最适浓度为0.5U,Mg^2＋最适浓度为2.0 mmol/L,模板DNA最适用量为5 ng/μL,dNTP最适用量为0.2 mmol/L,引物最适浓度为0.6μmol/L;引物最佳退火温度为50.0℃。利用20个黄瓜材料验证此反应体系,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在100-300 bp之间多态性高,且反应体系的稳定性和重复性好。

思茅松SSR-PCR反应体系优化研究

以思茅松杂交亲本JG1号基因组DNA为模板,利用正交设计实验对影响SSR-PCR反应体系的主要因子进行了优化,建立了一套最佳思茅松SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL最佳反应体系中,各组分最佳含量分别为Mg^(2+) 2.0 mmol/L、DNA 60 ng、引物0.50μmol/L、Taq DNA聚合酶0.25U、dNTP 0.20 mmol/L。利用11份个体对此SSR反应体系进行验证,获得扩增谱带清晰且多态性较好,证明该体系稳定可靠。

正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选

以大豆(Glycine maxL.)为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对大豆SSR扩增结果的影响,并确定影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量。以CTAB法提取的大豆叶片DNA为模板,应用L16(44)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响。大豆SSR-PCR优化反应体系为:2.0μL10×PCRBuffer,30 ng模板DNA,150μmol/LdNTP,0.4μmol/LSSR引物,1.5 UTaqDNA聚合酶,2.0 mmol/L Mg2+,加ddH2O至终体积20.0μL。优化的PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸5 min,4℃保存。同时选用200对大豆引物对2份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物74对,用于大豆SSR标记的进一步研究。

苦荞SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了保证SSR-PCR的重复性,快速找到最优的水平组合,采用交互正交设计L27(313)对苦荞SSR-PCR反应体系进行了5因素(Mg2+、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物)3水平优化试验,并对148对SSR引物进行了筛选。结果表明:5个单因素和2个交互作用(Mg2+×dNTP、Mg2+×Taq酶)对苦荞SSR-PCR均有极显著影响;最佳反应体系为:20μL总体积,Mg2+1 mmol/L,dNTP 0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA30 ng,引物0.25μmol/L,10×buffer 2μL。运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,电泳结果显示,扩增条带清晰,重复性好。利用148对SSR引物对滇宁一号、九江苦荞、野苦荞进行扩增,选出具有多态性的引物26对,可用于苦荞遗传多样性分析及遗传图谱构建。

正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系

以SDS法提取的狗牙根(Cynodon spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg^(2+)、dNTP、引物和DNA聚合酶4种因素三个水平,对SSR扩增效果进行研究,并通过比较不同浓度模板DNA的浓度对PCR扩增的影响,确立适合狗牙根SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响,狗牙根SSR-PCR优化反应体系为:10×buffer、60 ng模板DNA、Mg^(2+)2.5 mmol/L、dNTP 200μmol/L、primer 0.8μmol/L和Taq DNA聚合酶0.5U,总体积10μL。运用该体系对包括三种10份优良坪用型狗牙根进行了检验,证明该体系稳定可靠。这一优化体系的建立为今后利用SSR标记技术进行狗牙根遗传多样性研究、种质资源鉴定以及亲缘关系分析等提供依据。

大豆SSR-PCR反应体系优化

应用单因素试验和L16(45)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系。各因素不同水平对PCR反应结果均有影响,优化后的大豆SSR反应体系为:2.0 mmol/L Mg2+、1.00μmol/L引物、0.150 mmol/L dNTP、0.5 UTaq酶、50ngDNA模板。运用优化后的反应体系对大豆进行多态性引物的筛选,从140对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物45对。

正交设计优化柿属植物SSR-PCR反应体系

为了快速有效地确定柿属植物SSR-PCR反应体系,给柿属植物遗传多样性的SSR标记研究奠定基础,采用正交设计的方法,利用2×Taq PCR Master Mix,将Taq酶、dNTPs和Mg2+3个因素作为整体,综合评价其对柿属植物SSR-PCR反应体系的影响。结果显示:反应各因素水平对PCR反应均具有显著影响,其中Mix影响最大,引物次之,模板DNA最小;确定柿属植物SSR-PCR反应体系为模板DNA 2μL(40～100 ng)、2×TaqPCR Master Mix 10μL、引物1μL,总体积25μL;反应体系具有较高的重复性和稳定性,筛选出20对多态性较高的柿属植物SSR引物。

油茶SSR-PCR反应体系的优化研究

[目的]优化油茶(Camellia oleifera)SSR-PCR反应体系。[方法]应用改良CTAB法提取油茶基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响油茶SSR-PCR反应体系的5个因素(Taq聚合酶浓度、模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Mg2+浓度)在4水平上进行筛选。PCR结果经统计分析软件DPS分析,并对退火温度进行了摸索,确立了油茶SSR-PCR的优化体系。[结果]油茶SSR-PCR的优化体系总体积为20μl,包括Taq聚合酶量为1.0 U/20μl,模板浓度75 ng/20μl,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Mg2+浓度为1.50 mmol/L,退火温度为50℃。[结论]该研究确定的优化体系可以为油茶资源遗传多样性分析奠定技术基础。

白及SSR-PCR扩增体系的优化

目的优化白及SSR-PCR扩增体系。方法响应面法对10μL扩增体系中的模板DNA质量浓度、引物浓度、2×PCR mix用量进行配比寻优,再取5对EST-SSR引物和4份种质,分别在10、25μL扩增体系中对上述方案进行扩增验证。结果 10μL白及SSR-PCR中模板DNA质量浓度、引物浓度、2×PCR mix用量最优配比分别为1. 60 ng/μL、12μmol/L、6. 98μL。在5对引物分别于4份种质的扩增中,以最优配比构建的2种体系均能扩增出稳定清晰的条带。结论本实验可对白及SSR分子标记的研究奠定坚实基础。

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+>Taq DNA聚合酶(引物)>DNA模板>10×PCR Buffer>d NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。

澳洲坚果SSR-PCR反应体系优化及其应用

以澳洲坚果DNA为模板,通过单因素设计方法对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素进行了优化。结果表明,澳洲坚果SSR-PCR反应体系的最适条件为:20μL的反应体系中,包含30mg·L^(-1)模板DNA,1.0UTaq聚合酶,2.5mmol·L^(-1) Mg^(2+),0.6μmol·L^(-1)引物和0.3mmol·L^(-1)dNTPs。采用该反应体系对不同引物和15份澳洲坚果种质进行验证,扩增条带的可靠性和稳定性良好,且分辨率较高。因此,该SSR-PCR反应体系可用于澳洲坚果种质源鉴定及遗传多样性分析研究。

山生柳SSR-PCR反应体系优化

本研究以祁连山4个海拔梯度的山生柳(Salix oritrepha)为材料,采用L9(34)正交试验设计和单因子试验,分析山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物SHUK123的适宜退火温度进行优化。结果表明,PCR反应体系的最佳条件:20μL体系中2.0mmol·L-1 Mg2+1μL,0.10mmol·L-1 dNTPs1.5μL,0.5UTaq酶用量为1μL,20ng·μL-1 DNA模板1μL,0.5μmol·L-1的上下游引物各2μL,10×TaqBuffer 2μL,ddH2O加至20μL。扩增反应程序:94℃高温预变性时间3min,94℃变性45s,Tm(不同退火温度)退火时间45s,72℃延伸30s,循环数30个,最后72℃后延伸时间5min,4℃保温。适宜退火温度为56℃。以上结果表明,此反应体系在山生柳PCR扩增中的稳定性和可重复性较好。