水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

新型阿卡斑病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒(AKAV)的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测2019年6-10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR最佳反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0μL,上、下游引物(4μmol/L)各1.0μL,标准品或反转录产物2.0μL,双蒸水补齐至20.0μL。扩增程序:95℃预变性30 s;95℃30 s,64℃(S基因)/66℃(M基因)30 s,72℃30 s,进行40个循环。SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因和M基因的极限为1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数(CV)均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。

马Toll样受体表达水平SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种检测马Toll样受体(TLRs)mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR(Rverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)方法。参照GenBank中马TLRs的基因序列保守区设计特异性引物,以马β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立荧光定量RT-PCR方法。结果,扩增曲线在1×102～1×108copies.μL-1范围内有很好的线性关系,扩增相关系数在0.990以上,扩增效率在1.0左右。熔解曲线分析表明,产物为特异单峰,无引物二聚体,具有较高的特异性和灵敏度。重复性结果表明,该方法的组内、组间变异系数均小于3.50%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9在骨髓中均有表达,其中TLR4mRNA表达水平最高,TLR9mRNA表达水平最低。本研究建立的检测方法能够成功用于临床样品的检测,为研究马匹TLRs在mRNA水平的定量分析提供技术平台。

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测网状内皮增生症病毒方法的建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列LTR基因保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR GreenI模式的实时荧光PCR方法(Real-timePCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,并对方法的特异性、敏感性、可重复性以及再现性、检出率进行评价。结果表明,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应;熔解温度为86.8±0.5℃,无引物二聚体;扩增产物片段大小为270bp,与预期大小相符,测序结果证实为REV靶序列;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品,比常规PCR敏感103倍;组内变异系数、组间变异系数分别为4.80%～5.72%、0.75%～3.87%;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为REV序列。本研究建立的SYBR GreenI实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。

基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR建立生乳及乳制品沙门氏菌快速检测技术

生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测脑胶质瘤中RASSF1A mRNA

目的 建立检测RASSF1A(RASassociationdomainfamily 1ARASSF1A)mRNA的SYBRGreenⅠ实时定量PCR的方法 ,了解脑胶质瘤中RASSF1A的表达水平 ,研究RASSF1AmRNA的表达和肿瘤恶性程度的关系。方法 构建克隆载体作为定量模板 ,RocheLightCycler 定量检测 4 8例不同恶性程度胶质瘤组织和 6例正常脑组织标本。结果 4 8例脑胶质瘤组织中有 5例未检出RASSF1AmRNA。与内参照三磷酸甘油醛脱氢酶基因GAPDH(glyceraldehycle 3 phosphatedehydrogenase,GAPDH)比较后 ,RASSF1AmRNA的表达范围从 0 .0 8～ 1.0 0 /μg ,均值为 (0 .5 0± 0 .0 0 4 ) /μg。 6例正常脑组织标本均有RASSF1AmRNA的表达 ,范围从 0 .70～ 1.80 /μg ,均值为 (1.0 5± 0 .0 8) /μg。各期胶质瘤中RASSF1A的mRNA的表达水平均低于正常脑组织 ,但胶质瘤不同病理级别组之间的差异无显著意义。结论 胶质瘤中RASSF1A的mRNA的表达水平均低于正常脑组织。成功地建立了SYBRGreenⅠ实时定量检测RASSF1A基因表达方法 ,为研究RASSF1A表达水平下调的机制、表达水平和肿瘤的恶性程度、转移。

牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR快速检测鸭瘟病毒的研究

根据GenBank中鸭瘟病毒(DPV)UL6和UL7基因的保守序列,设计了一对特异性引物,扩增位于UL6和UL7基因第891～991位长度为101bp片断。以DPV标准强毒株DNA为模板,建立了SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒的方法,用该方法检测鸭瘟标准强毒、疫苗毒及野毒株均为阳性,检测其他受试的非鸭瘟病毒DNA均为阴性,对鸭瘟强毒和疫苗毒人工感染鸭胚尿囊液的检出率均为100%,对6个临床送检样本的检出率为6/6,与病毒分离鉴定结果一致;最小检出量为1.57×104拷贝/ul。

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快捷、特异、敏感检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物,经过对反应条件进行优化,建立了检测PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。该方法对常见的病毒均未检测到荧光信号,而仅对PEDV检测为阳性,其灵敏度为57拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对26份疑似PEDV感染的病料样品进行检测,结果显示本研究所建立的方法对PED的检出率比常规PCR高23.07%。本实验建立的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可以用于临床PEDV的检测。

基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。

副溶血弧菌的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法建立

基于副溶血弧菌gyrB基因保守序列设计1对特异性引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测副溶血弧菌的方法。SYBR GreenⅠ实时定量PCR的Tm为90℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性;所制作的实时定量PCR扩增标准曲线在2.06×108～2.06×103拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.992,能对副溶血弧进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,且较传统方法敏感、操作简单,可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。

兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是一种具有高度传染性的疾病,严重威胁养兔业的健康发展。为了建立一种能够快速、高效、敏感的检测RHDV的方法,试验设计了一对特异性引物进行PCR扩增,得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序列,并将其克隆到p MD19-T载体中作为标准品建立标准曲线;在扩增区域内设计一对简并引物,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,优化反应条件,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果表明:该方法可检测到的模板的最低拷贝数为8.18×101copies,只能特异性扩增RHDV,pGM19-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和健康兔组织RNA的扩增均为阴性,具有良好的特异性和重复性;同时用此方法对人工感染家兔的内脏分别进行检测,结果表明SYBR GreenⅠ荧光定量PCR能快速检测到不同脏器中的兔病毒性出血症病毒RNA含量,可用于临床兔瘟病毒的检测。

基于分子信标及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量检测土壤中的汞

利用分子信标、单链核酸（ss DNA）及核酸染料SYBR GreenⅠ,通过同步荧光分析法,建立了一种高灵敏、高选择性土壤汞（Hg2＋）的定量检测方法。在该体系中,分子信标的荧光基团设计为荧光胺（FAM）,分子信标的环设计为与ss DNA互补,但有4个T碱基错配的序列。在Hg2＋存在时,分子信标的环与ss DNA通过＂T-Hg2＋-T＂特异性结合形成双链DNA,分子信标的茎被打开,荧光基团与猝灭基团分开,荧光恢复;同时,核酸染料SYBR GreenⅠ与双链DNA作用,SYBR GreenⅠ的荧光信号显著增强。SYBR GreenⅠ与FAM的最大激发波长与最大发射波长都很接近,通过同步荧光分析法检测时,两种荧光染料的荧光峰重叠,荧光信号增强,可实现Hg2＋的高灵敏检测。体系的最优检测条件为：缓冲溶液的p H=8.0,孵育温度为50℃,孵育4 min,缓冲溶液中Na Cl的浓度为30 mmol/L,SYBR Green I工作液的体积为100 0L。在优化条件下,Hg2＋浓度在5×10 10~4.0×10 8mol/L时,SYBR GreenⅠ及FAM总的荧光强度（ΔI,为体系在存在和不存在Hg2＋时的荧光强度之差）与Hg2＋浓度（C）间有良好的线性关系,其拟合的回归方程为ΔI=1.3949C＋19.3596（R2=0.9976）,方法检出限（3σ）为3×10 10mol/L。本方法操作简单、快速、选择性好、灵敏度高、重复性好。

猪瘟病毒强毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为准确快速诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,简称CSFV)强毒,对GenBank已公布的CSFV的基因组全序列进行分析,根据CSFV-5'NTR核苷酸序列设计1对特异的荧光定量引物,建立快速检测猪瘟病毒强毒株SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果表明,该法具有很好的敏感性,对猪瘟病毒最低检出量为10拷贝/μL;特异性强,与猪瘟兔化弱毒苗、伪狂犬病毒(简称PRV)、猪细小病毒(简称PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(简称PRRSV)、圆环病毒组织苗(简称PCV2)没有交叉反应;重复性好,变异系数(CV)为0.47%~1.36%。该方法可用于猪瘟病毒的快速检测。

猪博卡病毒1/2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速和高通量检测猪博卡病毒(PBoV)的方法,本研究根据GenBank中登录的PBoV 1/2型NS1基因高度同源保守序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测PBoV1/2的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法对常见的其它病毒均未检测到荧光信号,而仅对PBoV1/2检测为阳性;其灵敏度为45拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;组内和组间变异系数均小于5%。本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,为PBoV的早期诊断和定量分析PBoV感染程度提供参考。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量,10倍系列稀释后,做出标准曲线,作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR GreenⅠKit,该标准品可精确定量到10 copies/μL。结论制备的pGEM-SIVgag477质粒外标准品纯度高,SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA载量。

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-ti mePCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。

新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号。对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。