东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因筛选

目的寻找东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因。方法利用东方田鼠血清以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,将所得阳性克隆进行测序及生物信息学分析,确定目的基因。结果经3轮筛选,特异性噬菌体得到有效富集(857倍),随机挑取58个克隆进行序列测定,获得了10条表达序列标签(EST)序列,其中7条与GenBank中登陆的日本血吸虫基因序列具有99%～100%同源性,1条与类人猿锌指蛋白基因有82%同源性。功能预测结果表明,大部分EST编码蛋白或多肽的功能主要是参与血吸虫基因表达调控。结论发现了多个可能与东方田鼠抗血吸虫抗性相关的靶基因,为进一步阐述东方田鼠抗血吸虫病的分子机理奠定了基础。

环介导同温DNA扩增技术鉴定血吸虫感染性钉螺方法的建立

目的建立一种快速鉴定血吸虫感染性钉螺的环介导同温DNA扩增方法。方法选择一个高拷贝的日本血吸虫基因SjR2的部分DNA序列作为扩增靶位,根据环介导同温DNA扩增原理设计合成引物,建立扩增该片段的环介导同温DNA扩增方法。使用此方法与聚合酶链反应(PCR)方法同时检测血吸虫感染性钉螺与正常钉螺的DNA,观察其应用价值。结果日本血吸虫SjR2基因的839～1 138 bp区段被成功扩增和克隆。利用根据该片段DNA序列设计合成的环介导同温DNA扩增反应的引物,成功地建立了能扩增该片段的环介导同温DNA扩增方法,其敏感性高于PCR法,能检出1 pg的血吸虫DNA。用此法检测30只感染性钉螺,阳性率为93.33%,而PCR的阳性率83.33%,两者差异有统计学意义(P<0.01)。结论环介导同温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺具有较高的敏感性,是一种潜在有效的血吸虫感染性钉螺鉴定方法。

日本血吸虫核糖体蛋白SjRPS4、SjRPL7 DNA疫苗对小鼠免疫保护作用研究

目的研究日本血吸虫核糖体蛋白SjRPS4、SjRPL7DNA疫苗对小鼠免疫保护作用。方法大量制备pcD-NA3.0/SjRPS4和pcDNA3.0/SjRPL7质粒DNA疫苗,昆明小鼠40只,随机均分为A、B、C和D组,A组为生理盐水(NS)组,每次肌肉注射100μL生理盐水;B组每只小鼠的股四头肌注射100μgpcDNA3.0裸质粒DNA;C组为pcDNA3.0/SjRPS4真核重组质粒组,每次肌肉注射质粒100μg/100μL;D组为pcDNA3.0/SjRPL7真核重组质粒组,每次肌肉注射质粒100μg/100μL。每隔2w同量加强免疫1次,共3次。末次免疫后第2w测定免疫各组血清特异性抗体效价后,经小鼠腹部皮肤人工感染20±1条日本血吸虫尾蚴。感染后第42d处死小鼠,计算减虫率和减卵率。结果与NS对照组比较,pcDNA3.0/SjRPS4和pcDNA3.0/SjRPL7免疫组小鼠均获得了较显著的减虫率、肝减卵率、肠减卵率、每雌子宫减卵率。统计学处理,均有显著性差异。结论pcDNA3.0/SjRPS4和pcDNA3.0/SjRPL7DNA疫苗对小鼠均有较强的免疫保护效果。

肝基质与/或β-巯基乙醇对日本血吸虫细胞影响

目的研究肝基质与β-巯基乙醇分别及联合作用对日本血吸虫培养细胞的影响.方法冷消化法将虫龄为18 d的日本血吸虫童虫制成细胞悬液,联合法接种于普通小盖玻片和预先铺敷肝基质的小盖玻片上.前者被随机分为对照组与β-巯基乙醇组,后者被分为肝基质组与β-巯基乙醇+肝基质联合处理组(简称联合组).培养第1～4周,分别对各组细胞进行乳酸脱氢酶(LDH)染色,光镜下观察分析.结果培养第1周细胞的LDH活性最强;随着培养时间的延长,LDH活性逐渐降低.培养前2周,β-巯基乙醇组与联合组细胞的LDH活性相近,肝基质组与对照组的相近,前者强于后者,差异有统计学意义(P＜0.05).培养第3周始,肝基质组培养细胞的LDH活性最强,与其余组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);其余组之间两两比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论肝基质对日本血吸虫培养细胞LDH活性的促进作用比β-巯基乙醇稳定、长效;两者联合无协同作用.

日本血吸虫卵对小鼠溃疡性结肠炎保护机制的探讨

目的探讨日本血吸虫卵对小鼠溃疡性结肠炎保护作用的免疫调节机制。方法以10 000个日本血吸虫卵经腹腔注射免疫小鼠4次,每次间隔1周,末次免疫后6 d用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎模型,观察虫卵免疫组和未免疫组小鼠的细胞因子和调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)亚群CD4+CD25+Foxp3+水平的变化。结果未经虫卵免疫的小鼠经TNBS诱导后结肠炎症状明显,细胞因子IFN-γ水平高达3.47±0.87 ng/ml,IL-4I、L-5和IL-10水平则较低分别为146.06±45.76 pg/ml,140.32±39.01 pg/ml,385.91±134.89 pg/ml;经虫卵免疫的结肠炎小鼠的炎症得到明显控制,IFN-γ表达被明显抑制其水平为1.53±0.51 ng/ml,IL-4I、L-5和IL-10水平显著升高分别为598.50±135.90 pg/ml,217.86±77.82 pg/ml,799.651±197.93 pg/ml。经虫卵免疫的结肠炎小鼠脾脏CD4+CD25+FoxP3+T细胞亚群比例为(3.55±0.81)%,显著高于未免疫组结肠炎小鼠的(2.31±0.39)%。结论日本血吸虫卵免疫对TNBS诱导的结肠炎小鼠具有保护作用,其保护性机制可能与CD4+CD25+FoxP3+T细胞对Th1过度反应的反馈性调节有关。

日本血吸虫超氧化物歧化酶的表达与免疫活性鉴定

目的表达日本血吸虫胞浆内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),并研究其免疫原性。方法采用反转录PCR方法从血吸虫成虫mRNA中扩增出SOD基因序列,再亚克隆到表达载体pGEX-4T-3中构建重组表达质粒并转化到E.coli BL21(DE3)中。用IPTG对含有重组质粒的转化子细菌进行诱导表达重组的GST-SOD蛋白。用重组GST-SOD蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫印迹试验观察重组GST-SOD融合蛋白的免疫原性。结果日本血吸虫胞浆内SOD基因被成功地扩增,并构建成功含此基因的重组表达质粒Sj SOD-pGEX-4T-3。含重组质粒的E.coli在IPTG的诱导下能表达一大小约43kDa的GST-SOD重组蛋白。用此蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平最高能达1∶12800,该重组蛋白可以被血吸虫重感染兔血清所识别。结论日本血吸虫中国大陆株胞浆内SOD表达成功,并具有良好的免疫原性。

日本血吸虫泛素活化酶E1基因的克隆、表达及鉴定

目的扩增并表达日本血吸虫泛素活化酶E1蛋白。方法利用PCR技术得到E1基因序列,并将其克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹(Western blot-ting)分析表达产物与鉴定其免疫反应性。结果SjE1基因开放阅读框长651bp,编码217个氨基酸残基,Western blotting分析结果表明,纯化的SjE1蛋白能被疫区居民血吸虫抗体阳性者血清、急性及慢性及晚期血吸虫病患者血清识别,与健康人血清无反应。结论日本血吸虫蛋白基因SjE1在体外获得表达,其表达蛋白具有一定的抗原性。

日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

目的克隆、表达日本血吸虫线粒体外膜转运酶34基因(SjTOM34),并对其生物特性进行初步研究。方法应用RT-PCR方法从42d日本血吸虫成虫cDNA中扩增SjTOM34基因,并进行生物信息学分析。应用实时定量RT-PCR方法分析了SjTOM34基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达状况。构建了SjTOM34基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,Western blotting分析了重组抗原的免疫原性及该蛋白在不同发育阶段虫体中的表达情况,利用免疫组化方法观察了该蛋白在虫体内的分布情况。结果获得了SjTOM34的基因序列,其开放阅读框(ORF)为1 083bp。该基因在所检测的不同发育阶段童虫和成虫中均有表达,其中在35d虫体中的表达量略高于其他时期的虫体。成功构建了重组的原核表达质粒并且在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在,并且具有较好的免疫原性,在所检测的各时期虫体中均可检测到该蛋白的存在,并且主要分布在虫体的实质组织中。结论获得了日本血吸虫SjTOM34基因,初步明确了该基因在日本血吸虫童虫和成虫中的表达情况,及在成虫中的分布。

日本血吸虫GST、Sj23及GST-Sj23 RNA颗粒抗原的制备及表达研究

目的制备日本血吸虫自杀性RNA颗粒抗原,并研究其在真核细胞内的表达,以期探讨新型抗原的研制方法,为制备抗血吸虫疫苗奠定基础。方法将编码日本血吸虫主要抗原GST、Sj23及编码两种抗原的嵌合基因(GST-Sj23)分别克隆到自杀性RNA疫苗载体SFV3.spider内,以体外转录法制备编码上述三种抗原的mRNA。同法合成编码SFV病毒表膜蛋白质(S蛋白质和C蛋白质)的mRNA,然后将编码上述三种抗原的mRNA分别与编码病毒膜蛋白质的mRNA混合,以电穿孔法导入BHK21细胞,制备含有日本血吸虫GST、Sj23抗原及GST-Sj23嵌合体抗原mRNA的假病毒颗粒。最后,对制备出的假病毒颗粒进行真核细胞感染实验,以间接免疫荧光法验证上述抗原的真核表达情况。结果三种RNA颗粒对BHK21细胞均具有很好的感染性,所编码的蛋白质在BHK21细胞内鉴定高效表达。

日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的扩增和克隆

目的克隆日本血吸虫14-3-3抗原的编码基因,以研究其用于血吸虫病免疫诊断和免疫预防效果。方法以日本血吸虫成虫RAN为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增14-3-3抗原基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出一条约780bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增出大小相同带。结论日本血吸虫14-3-3抗原重组pGEM-T克隆载体的成功构建,为进一步的研究提供了条件。

5-羟色胺体外对日本血吸虫母胞蚴运动性与体长的影响

目的研究5-羟色胺(5-HT)体外对日本血吸虫母胞蚴运动性和体长的影响,并筛选5-HT作用的最适浓度与时间。方法取感染6￣8周日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化收集毛蚴,于1/2RPMI1640培养基(含10%小牛血清和常量抗生素)中培养48h。待毛蚴转化为母胞蚴后,将一部分母胞蚴分别培养于浓度为0、0.1、1、10、100和1000μmol/L的5-HT培养基中48h,另一部分母胞蚴用10μmol/L5-HT分别培养0.16、6、24和48h,测定母胞蚴的活动率、体长与琥珀酸脱氢酶活力。结果用不同浓度5-HT培养母胞蚴48h,随着5-HT浓度的增加,母胞蚴的活动率及体长均逐渐增加,浓度为10μmol/L时两者均达到最大,分别为(65.6±1.5)%和(131.4±9.2)μm。用10μmol/L5-HT培养时,随着培养时间的延长,母胞蚴的活动率、体长、琥珀酸脱氢酶活力均逐渐增加,24h时活动率达最大,48h时体长最长和琥珀酸脱氢酶活力最强。结论5-HT能显著影响体外培养的日本血吸虫母胞蚴的运动性和体长,其作用的适合浓度为10μmol/L。

双嗜性逆转录病毒感染日本血吸虫细胞的生物学理论与可行性探讨

目的探讨用双嗜性逆转录病毒载体将外源基因导入日本血吸虫(Sj)细胞的生物学理论与实验依据。方法用生物信息学方法对双嗜性逆转录病毒rRam-1受体同源性分布、结构与功能作系统的分析与比较;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞,经PCR和RT-PCR检测感染细胞目的基因(E77.43)的整合与表达。结果根据生物信息学分析结果推断,Sj细胞膜上存在的SjCHGC09605和SjCHGC05362两种蛋白为非分泌性跨膜蛋白,可能具有细胞膜离子转运通道或受体蛋白的功能及双嗜性逆转录病毒感染的膜受体样作用,可能参与病毒对细胞的吸附和穿入过程;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞后,用PCR及RT-PCR检测到目的基因整合与表达,扩增的目的片段大小为330 bp,与理论值相符。结论用载有E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞获得成功,推测SjCHGC09605和SjCHGC05362两种与rRam-1受体同源的蛋白可能是Sj感染过程中起作用的分子。研究结果为下一步用双嗜性逆转录病毒载体转导永生化基因到Sj细胞提供了生物学理论与实验依据。

p47 GTP酶在日本血吸虫感染中的应答特征

目的建立日本血吸虫感染小鼠模型,研究IGTP和IRG-47在日本血吸虫感染中的作用特点及参与免疫应答的能力。方法以IGTP基因敲除(IGTP KO)小鼠、IRG-47基因敲除(IRG-47KO)小鼠和野生型C57BL/6J小鼠(WT)为研究对象,建立日本血吸虫感染实验模型。感染10周后计数成虫数和虫卵数,以HE染色观察肝脏的病理变化,以间接ELISA法检测血清中日本血吸虫特异性IgG抗体,以RTQ-PCR检测脾细胞中细胞因子和趋化因子的mR-NA表达水平。结果日本血吸虫感染10周后,IGTP KO小鼠与WT小鼠虫荷数和卵荷数差异无统计学意义(P<0.05),IRG-47KO小鼠的虫荷数和卵荷数均低于IGTP KO和WT小鼠。IRG-47KO组小鼠肝脏单个虫卵肉芽肿面积显著小于IGTP KO组和WT组(P<0.05)。日本血吸虫感染10周后,IGTP KO小鼠SWAP和SEA特异IgG2a水平高于IRG-47KO小鼠和WT小鼠(P<0.05);IGTP KO小鼠脾细胞il12、il4mRNA表达高于WT小鼠(P<0.05),且if-ng表达高于IRG-47KO小鼠(P<0.05);IRG-47KO小鼠趋化因子ccl3、cxcl9、cxcl10mRNA表达显著低于IGTP KO小鼠和WT小鼠(P<0.05)。结论 IRG-47缺失对日本血吸虫感染有一定保护作用,IRG-47KO小鼠肝脏病理特征与其趋化因子的表达相一致。