Shaker通道电压感受器S3-S4片段末端氨基酸分析

目的探讨分析传统Shaker通道电压感受器S3-S4在膜中所处的位置。方法采用膜拓扑结构分析和糖基化扫描方法,对传统Shaker通道的电压感受器S3-S4在膜中所处位置进行分析。结果 Shaker通道中,S3以Nexo/Ccyt方式插入到膜中,其C端终止于T329,S4以Nexo/Ccyt方式插入到膜中,其N端终止于L358。结论 Shaker通道电压感受器S3-S4为跨膜片段,与电压门控机制中传统的Shaker模型一致。

普通烟草外向整流Shaker K^(+)通道NtSKOR1的组织表达分析

外向整流Shaker K^(+)通道SKOR(Stelar K^(+)outward rectifier)是一类定位于植物根部中柱细胞质膜的外向整流Shaker K^(+)通道。为探究普通烟草NtSKOR1的启动子活性和不同时期组织表达情况,克隆该基因上游2439 bp的启动子序列,创制启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的烟草材料并进行组织化学染色,通过RT-qPCR验证该基因的表达。结果表明NtSKOR1启动子含有光响应、逆境胁迫和激素等相关的顺式作用元件;转ProNtSKOR1::GUS烟草的组织化学染色试验表明:萌发期至子叶展平期未检测到GUS活性;小十字期,在真叶叶脉和茎尖分生组织开始检测到GUS活性;生根期,除茎和叶脉的维管组织外,在根部维管组织也开始检测到明显GUS活性,且活性随烟株生长而逐渐增强;盛花期,主要在烟草的根、茎和叶脉维管组织检测到活性,且上部叶叶脉中的GUS活性高于下部叶叶脉。RT-qPCR与GUS活性检测结果基本一致。综上可知,NtSKOR1主要在烟草小十字期及后续发育阶段的根、茎、叶的维管组织中表达,烟草进入盛花期后,该基因在光合作用较强的上部叶中的表达高于下部叶,推测该基因可能参与烟草K^(+)转运和同化产物协同运输。

山新杨钾离子通道基因PdbSKOR的克隆与功能分析

【目的】植物SKOR是典型的外向整流型Shaker类钾离子(K+)通道蛋白,介导根部K+向地上部的长距离运输。本研究克隆并鉴定杨树K+通道基因PdbSKOR,在转录水平探讨其组织特异性表达特征及对缺钾、高钾、干旱和低温胁迫的响应情况,并明确其电生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在山新杨中鉴定并克隆1个K+通道基因PdbSKOR;运用MEGA 7.0软件构建山新杨等14种不同科属木本植物SKOR通道成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析PdbSKOR的组织特异性表达特征及在转录水平根部PdbSKOR对缺钾、高钾(60 mmol·L-1 KCl)、干旱(15%PEG6000)和低温(4℃)处理的响应情况;借助膜片钳系统研究PdbSKOR的电生理功能。【结果】在山新杨中克隆1个K+通道基因PdbSKOR(GenBank No.MT335814),其编码蛋白含有6个离子通道跨膜域(S1—S6)、环核苷酸结合域、Ankyrin锚蛋白域和KHA二聚体功能结构域,属于典型的Shaker类K+通道;14种木本植物SKOR蛋白的氨基酸一致性高达81.09%,S6跨膜区的氨基酸一致性最高(96%);不同科属植物的SKOR同源蛋白在遗传进化关系上差异较大,而同一科属植物的遗传距离较近,山新杨PbdSKOR与同属杨柳科的红皮柳的同源蛋白SpuSKOR的遗传距离最近;在PdbSKOR启动子区域预测到18种顺式作用元件,主要包括发育调控、激素响应和胁迫响应等相关的调控元件;实时荧光定量PCR表明PdbSKOR在3年生山新杨根部的相对表达量最高,其次是盛开期花和花序,在茎部、叶片和果絮中的表达量相对较低;PdbSKOR在组培幼苗根部的表达水平也是最高的,且在转录水平对高钾处理没有响应,但对缺钾、干旱和低温胁迫处理较为敏感,其中,PdbSKOR在幼苗根部的表达水平受缺钾或干旱处理的抑制均显著降低,受低温胁迫诱导而显著增强;膜片钳研究表明当细胞膜电位为+20 mV时,PdbSKOR离子通道即被激活,并记录到典型的外向整流电流,并随胞外K+浓度的降低而增大,且正向电压越大,内向整流的电流越强,表明PdbSKOR是一个电压依赖的外向整流型K+通道。【结论】从山新杨中克隆并鉴定了1个K+通道基因PdbSKOR;山新杨PdbSKOR与红皮柳SpuSKOR在系统进化关系上最近;PdbSKOR主要在山新杨根部(成年树和幼苗)表达,幼苗根部PdbSKOR在转录水平受缺钾、干旱和低温胁迫的调控;PdbSKOR是山新杨根部主导K+外排的通道。

葡萄钾离子通道基因VviSKOR的克隆、表达及电生理功能

【目的】从葡萄中克隆并鉴定钾离子通道基因VviSKOR,在转录水平分析其组织特异性表达特征及对缺钾、氯化钠(NaCl)与脱落酸(ABA)等胁迫的响应情况,通过膜片钳电生理技术研究其生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定钾离子通道基因VviSKOR;借助多种生物信息学软件分析葡萄SKOR及其编码蛋白的特征;利用MEGA 7.0软件建立葡萄、拟南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、大豆、番茄、黄瓜、白杨、桃、梨、草莓、苹果、木瓜、柑橘、香蕉、凤梨等18种不同科属植物SKOR同源蛋白成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析VviSKOR在葡萄不同组织部位的表达模式及对缺钾、NaCl、ABA与sorbitol等胁迫的响应情况;利用膜片钳电生理系统分析葡萄VviSKOR的生理学功能。【结果】在葡萄基因组中克隆获得一个钾离子通道基因VviSKOR,其编码蛋白含有环核苷酸结合域、离子通道跨膜域、Ankyrin repeats和KHA功能结构域,属于典型的Shaker类钾离子通道;18种不同科属植物SKOR蛋白在氨基酸水平具有58.92%的一致性,系统进化树表明葡萄VviSKOR与黄瓜CsaSKOR紧密聚在一起,其遗传进化关系上较近,4种禾本科植物(玉米、水稻、短柄草和高粱)SKOR家族成员在系统进化树上更倾向于聚在一起,而同属蔷薇科植物(草莓、苹果、梨和桃)SKOR在进化关系上紧密聚在一起;亚细胞定位预测表明葡萄VviSKOR蛋白主要定位于细胞质膜,且含有6个跨膜区,其等电点PI为6.24,表明该蛋白含有偏酸性氨基酸残基较多;在VviSKOR启动子区域预测到12种顺式作用元件,主要包括胁迫响应、激素响应和细胞周期调控等不同生命活动相关的调控元件;数据库表达谱分析结果表明葡萄VviSKOR在多种组织或器官中均有表达,在葡萄树根中的表达水平最高,其次是叶和木质部;实时荧光定量PCR分析表明VviSKOR在7年生‘马瑟兰’葡萄树根部和幼苗根部的表达水平均最高;幼苗中,VviSKOR在转录水平对高钾处理没有响应,但对缺钾、ABA和NaCl胁迫处理较为敏感,其在检测幼苗根部、茎部和叶片中的表达量均被缺钾和ABA抑制而降低,却受NaCl胁迫诱导而显著增强;转染pTracer-CMV3-SKOR质粒的HEK293-T细胞记录到外向电流,且随细胞外钾离子浓度的增加而降低,表明VviSKOR为一外流型钾离子通道,此外,记录到的电流随着电压的增加而增加,说明VviSKOR也是电压依赖型钾离子通道。【结论】葡萄VviSKOR与黄瓜CsaSKOR在遗传进化关系上最为相近;VviSKOR主要在葡萄根部(成年树和幼苗)表达,幼苗中VviSKOR在转录水平受缺钾、ABA和NaCl胁迫的调控;VviSKOR是葡萄根部主导钾离子外排的钾离子通道。

杧果钾通道基因MiSPIK的克隆、表达与功能分析

Shaker类型钾通道在植物生长发育中起重要作用,其在果树中的生物学功能依然未知。克隆并揭示杧果SPIK钾通道基因的功能,为研究热带果树Shaker类型钾通道的生物学功能提供基因资源和理论基础。以杧果品种‘桂热82’为材料,利用RACE-PCR技术克隆Shaker类型钾离子通道基因MiSPIK(GenBank ID:OM179914),利用生物信息学手段分析该基因及编码蛋白的序列特征,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析该基因的组织特异性表达特征,及其在转录水平对缺钾、高钾、低温、NaCl和PEG处理等5种非生物胁迫的响应情况,并创制MiSPIK超表达转基因拟南芥株系。结果显示,MiSPIK蛋白的分子量为90006.83 kD,等电点(pI)为7.59,含有6个跨膜结构,属于不稳定的亲水蛋白。杧果MiSPIK与梨PbrSPIK和拟南芥AtSPIK的氨基酸序列一致性高达59.46%,三者紧密聚为一类,遗传距离最近。在转录水平上,MiSPIK在杧果花粉中特异性表达,并在一年生嫁接苗根部受缺钾或NaCl处理的抑制均显著降低,受高钾、PEG或低温胁迫诱导而显著增强。MiSPIK在拟南芥中表达后增强了转基因株系的钾素富集能力,并促进转基因植株提早抽薹和开花。杧果MiSPIK是花粉中特异表达的Shaker类型钾通道基因,其表达水平易受多种非生物胁迫的调控,可能在杧果钾素营养高效与利用中发挥作用。

林烟草Shaker钾通道基因NsylNKT6启动子的克隆与功能分析

Shaker家族钾离子通道在植物钾素的吸收转运中发挥重要作用。前期从林烟草(Nicotiana sylvestris)中克隆到Shaker家族GroupⅡ的一个成员NsylNKT6,但其具体的组织表达模式尚不清楚。本研究以林烟草基因组DNA为模板,克隆获得NsylNKT6上游长1981 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,NsylNKT6启动子含有多个光、激素和胁迫等响应元件及分生组织表达元件。利用叶盘转化法,获得转NsylNKT6启动子驱动GUS报告基因的林烟草材料。GUS染色结果显示,正常培养条件下,在林烟草出苗期的叶片保卫细胞检测到GUS活性;在林烟草团棵期,叶片的叶脉维管组织、腺毛及保卫细胞均检测到GUS活性。上述结果表明NsylNKT6在保卫细胞、叶脉维管组织和腺毛细胞中表达。推测该基因可能通过调节钾吸收参与气孔运动,或介导维管组织和腺毛中的钾离子吸收转运过程,且其表达可能受光、激素和胁迫等的调控。本研究为解析NsylNKT6钾通道的生理功能提供理论基础。

检测钾离子通道的小分子荧光探针的研究进展

钾离子通道是分布最为广泛、种类繁多的一类离子通道,因其生理功能的多样性,已成为许多疾病的药物作用靶点。近年来,许多化学结构不同的药物均因钾离子通道阻滞引起的严重心肌毒性而被撤出市场,使得小分子药物的钾通道抑制活性筛选面临重大挑战。介绍检测钾离子通道的小分子荧光探针的研究进展,并总结小分子荧光探针的作用机制,为今后小分子荧光探针的设计提供思路,使得小分子荧光探针可以广泛应用于候选药物的高通量筛选、钾离子通道的活体成像与检测。