一株耐高乙醇和低pH己酸产生菌Lysinibacillus fusiformis-pBE_3-ep-SigB的构建

以Lysinibacillus fusiformis为出发菌,分别转染Sig A和Sig B突变基因,获得耐高乙醇和低p H胁迫的优良己酸产生菌。以p ET32a(+)-Sig A/Sig B为模板,采用均匀试验优化Sig A/Sig B易错聚合酶链式反应(ep PCR)扩增体系中的Mn^(2+)和Mg^(2+)浓度,通过ep PCR获得ep-Sig A/Sig B突变基因,与载体p BE_3-MCS连接后,构建L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig A/Sig B突变菌体库,将两种菌体库在p H值2~5和乙醇含量2%~12%条件下进行筛选。结果表明,L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig B重组菌株耐受最高乙醇含量为8%左右,最低耐受p H值为2.5左右;当乙醇含量为8%、p H值为3.5时,L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig B重组菌株的己酸产量达到(254.35±39.74)mg/100 m L,显著高于工程菌株L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig A的己酸产量(P<0.01),且为出发菌L.fusiformis己酸产量(93.62±10.33)mg/100 m L的271.68%,表明L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig B重组菌株具有较强的抗高乙醇浓度和低p H值胁迫产己酸的能力。

金黄色葡萄球菌sigB基因同源重组质粒构建的研究

目的:构建金黄色葡萄球菌sigB基因的同源重组质粒,为进一步研究其生物膜的形成机制奠定基础。方法:将“sigB上游序列-卡拉霉素抗性基因-sigB下游序列”目的片断以金黄色葡萄球菌X387基因组DNA和pEGFP-N2质粒分别进行PCR扩增,其中3个片段互连的末端以其本身的序列互补,两端分别携带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,并采用融合PCR法进行片段连接;按pBluescriptⅡSK(+)质粒说明书构建含连接片断的质粒,分别将重组pBluescriptⅡSK(+)质粒和载体质粒pGEM-7zf(+)用SacⅠ和XhoⅠ双酶切后,用T4连接酶构建pGEM-7zf(+)-sigB基因同源重组质粒。结果:同源重组质粒经PCR扩增出目的片断,且琼脂糖凝胶电泳和测序证实目的片断正确。结论:金黄色葡萄球菌sigB基因同源重组质粒构建成功。

炭疽芽胞杆菌sigB基因缺失株的构建与研究

目的构建炭疽芽胞杆菌A16R株sigB基因缺失突变株,通过分析其表型,为后续的炭疽杆菌生命过程展开系统性研究奠定基础。方法采用同源重组技术以sigB为目标缺失基因,利用Golden-gate法构建含同源臂的打靶载体,结合基于I-SceⅠ酶驱动的芽胞菌高效敲除体系,筛选出炭疽杆菌sigB缺失突变株。通过生长曲线绘制、芽胞形成率测定、糖代谢能力比较,以及抗逆性实验等进行表型分析研究。结果成功构建了炭疽杆菌sigB缺失突变株,发现SigB对细菌生长能力、芽胞形成率和糖代谢能力均无显著影响。在抗逆性实验中,经不同浓度H2O2作用下,与野生株相比,sigB缺失突变株抑菌环无明显差异。经过48与55℃处理后,与A16R野生株比较,sigB缺失突变株菌落数减少,说明sigB缺失突变株抗热性减弱。结论成功获得了炭疽杆菌sigB基因缺失突变株。该研究表明SigB不影响芽胞形成,对细菌的抗热性有显著影响。

MALDI-TOFMS鉴定一株小菌落变异型金黄色葡萄球菌

目的探讨运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术对金黄色葡萄球菌小菌落变异型的特征性蛋白指纹图谱进行深度研究的价值。方法分别采用传统生化鉴定、16S r RNA测序技术和MALDI-TOF MS技术对1株小菌落变异型金黄色葡萄球菌进行鉴定,通过质谱鉴定系统VITEK MS的质谱科研模式获取金黄色葡萄球菌小菌落突变株(small colony variants,SCV)的质谱图,分析代表金黄色葡萄球菌agr和sig B系统的m/z表达强度,并用SARAMIS软件构建基于质谱峰谱特征的系统发育树。结果使用MALDI-TOF MS技术鉴定该菌株为金黄色葡萄球菌,与传统生化鉴定、16S rRNA测序技术的鉴定结果一致。其菌落形态符合典型SCV菌株的特征,预示生物膜形成的PSMα3(m/z 2634.4)、PSMα1(m/z 2286.8)和PSMα4(m/z 2198.6)的表达强度分别为100%、76.1%和32.3%,反映急性早期感染状态的agr调控系统的delta毒素强度只有10%;反映慢性、复发性感染的sigB调控系统的峰谱相对强度均<25%,该菌株和科研菌种库SCV的系统发育树近似度>70%。结论 MALDI-TOF MS技术不仅能够快速准确鉴定不典型金黄色葡萄球菌,且生成的质谱图能够初步提示菌株在宿主体内的感染状态,表明该技术具有极大的应用前景。