miR-10b靶向TGFBR1/SMAD3通路对特发性矮小症的软骨细胞增殖、肥大的影响机制

目的研究miR-10b对特发性矮小症(ISS)的影响及作用机制。方法收集ISS患儿(ISS组)和体检健康儿童(健康对照组)各54例,qPCR检验血清miR-10b表达量,分析ISS组患儿血清miR-10b表达与患儿临床资料的关系。采用miR-10b inhibitor、si-TGFBR1及各自阴性对照转染C28/I2细胞,利用CCK-8实验检测C28/I2细胞增殖能力,Western blot检测侏儒相关转录因子2(RUNX2)、X型胶原α1链(COL10A1)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、SMAD3、pSMAD3蛋白表达量。在StarBase数据库筛选miR-10b靶点,利用双萤光素酶报告基因实验验证miR-10b与TGFBR1的靶向关系。结果ISS组血清miR-10b表达量高于健康对照组,且miR-10b表达越高,患儿的身高、IGF-1、骨特异性碱性磷酸酶的下降越明显(P<0.05)。与NC组相比,miR-10b inhibitor组细胞增殖能力升高,RUNX2、COL10A1、TGFBR1、pSMAD3蛋白表达上调(P<0.05);StarBase数据库提示miR-10b存在TGFBR1的结合位点,双萤光素酶报告基因实验证实两者结合。与si-NC相比,si-TGFBR1组TGFBR1表达量下调,细胞增殖能力下降(P<0.05)。结论miR-10b通过靶向TGFBR1/SMAD3通路在特发性矮小症中抑制软骨细胞的增殖、肥大。

选择性上调pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞增殖及α平滑肌肌动蛋白、纤维酶原激活物抑制剂-1和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的观察选择性上调pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞(LX 2)增殖及α平滑肌肌动蛋白(α SMA)、纤维酶原激活物抑制剂 1(PAI 1)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)表达的影响。以进一步探究pSmad 3C/3L在肝纤维化进展中的作用机制。方法采用脂质体转染的技术(FuGENE?HD)向LX 2细胞转染野生型Smad3基因(Smad3 WT)、Smad3连接区磷酸化位点突变的基因(Smad3 EPSM)及Smad3 C末端磷酸化位点突变的基因(Smad33S A)3种质粒,选择性上调LX 2细胞中pSmad 3C/3L的表达水平,以蛋白质印迹法(Western Blot)验证转染效率并检测LX 2细胞中α SMA、PAI 1和Collagen Ⅰ的蛋白表达水平。MTT法检测选择性上调pSmad 3C/3L对LX 2细胞增殖能力的影响。结果转化生长因子 β1(TGF β1)刺激1 h后,与LX 2对照组相比,转染3种质粒组Smad3蛋白表达水平均升高[(0.48±0.02),(0.57±0.03),(0.60±0.02),(0.59±0.03);P<0.05];与Smad3 WT组相比,转染Smad3 EPSM质粒组pSmad3C蛋白表达水平明显升高[(0.33±0.02)比(0.44±0.01),P<0.05],转染Smad33S A质粒组pSmad3L蛋白表达水平明显升高[(0.36±0.01)比(0.42±0.02),P<0.05]。MTT结果显示,转染Smad3 EPSM质粒可抑制LX 2细胞增殖,而转染Smad33S A质粒可促进LX 2细胞的增殖[吸光度值(0.48±0.03)比(0.93±0.05),P<0.05]。TGF β1刺激12 h后,α SMA、PAI 1和Collagen Ⅰ在3种质粒转染组中呈现出差异表达(P<0.05)。结论转染3种质粒成功地选择性上调了LX 2细胞中pSmad 3C/3L的表达,选择性高表达pSmad3L可进一步促进TGF β1诱导的细胞增殖反应、促进α SMA、PAI 1和Collagen Ⅰ的表达,选择性高表达pSmad3C可抑制细胞增殖反应、降低α SMA、PAI 1和Collagen Ⅰ的表达;提示TGF β1诱导的Smad3不同位点磷酸化在LX 2细胞增殖和α SMA,PAI 1,Collagen Ⅰ蛋白表达的调控中发挥重要作用,为肝纤维化的逆转提供了新思路。

转化生长因子胞内信号蛋白Smad2/3在糖尿病大鼠肾脏表达的动态观察及意义研究

目的:动态观察大鼠糖尿病肾病发生发展过程中TGF-β1及其下游信号分子Sm ad2/3在肾脏的表达及定位变化,探讨TGF-β1-Sm ad2/3信号通路在糖尿病肾病(DN)肾纤维化发病机制中的作用。方法:链脲菌素诱导大鼠糖尿病肾病,以免疫组化、W estern b lotting及荧光实时定量PCR(RT-PCR)的方法动态观察糖尿病肾病发生发展过程中大鼠肾脏TGF-β1、Sm ad2/3蛋白及mRNA表达,并以RT-PCR方法观察结缔组织生长因子(CTGF)、胶原-3(COL-Ⅲ)、纤溶酶原激活剂抑制因子-1(PAI-1)mRNA表达。结果:TGF-β1在糖尿病肾病(DN)大鼠肾小管表达明显多于正常组(P<0.05);Sm ad2/3蛋白主要以胞浆表达阳性为主,部分呈胞核表达阳性;Sm ad2/3蛋白及mRNA从2周起表达明显多于正常对照组(P<0.05),且随着糖尿病进展有逐渐增加的趋势。16周DN组大鼠肾脏TGF-β1、Sm ad2、CTGF、COL-Ⅲ、PAI mRNA表达显著高于正常对照组(P<0.05)。结论:TGF-β1-Sm ad2/3信号转导通路参与了糖尿病肾病肾脏纤维化形成的信号转导过程,伴随着Sm ad2/3信号蛋白表达的增多及入核增加,CTGF、COL-Ⅲ、PAI-1等基因转录增加,导致肾脏细胞外基质的大量沉积,这是细胞因子TGF-β1导致糖尿病肾病肾纤维化进展可能的信号转导途径之一。

TGF-β、Smad信号通路蛋白及α-SMA在糖尿病肾病患者肾组织中的表达和意义

目的检测转化生长因子(TGF)-β、Smad信号通路蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在糖尿病肾病(DN)患者肾活检组织中的表达,探讨DN的发病机制。方法收集DN肾组织标本28例(DN组);非DM行肾切除的正常肾组织10例为对照组。应用免疫组化方法检测TGF-β1、TGF-β受体(R)Ⅰ、TGF-βRⅡ、Smad2/3、α-SMA在肾组织中的表达。结果 (1)TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2/3在DN组和对照组中均有表达,前者高于后者,DN组早期光镜下肾组织未见明显异常时即有明显的高表达,而随着疾病的进展未见表达增高的现象。肾小球、肾小管出现纤维化后并不表达上述因子。(2)对照组的α-SMA仅表达于肾血管、肾小球和肾小管,而肾间质未见α-SMA表达,而DN组α-SMA在上述组织中均有表达。结论TGF-β及Smad信号转导通路参与了DN的发病,DN可能与免疫复合物性肾小球肾炎具有相似的发病机制。

转化生长因子-β1对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖及Smad3、Smad7表达的影响

目的:观察转化生长因子(TGF)-β1对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖能力及其Smad3、Smad7蛋白表达的影响。方法:体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞,分别给予不同剂量及不同作用时间的TGF-β1进行诱导,四甲基氮唑比色法检测细胞增殖能力变化,蛋白印迹法检测Smad3、Smad7蛋白的表达变化。结果:JEG-3细胞对TGF-β1的诱导作用表现为良好的浓度效应和时间效应。100、200μg/LTGF-β1作用后,细胞增殖率显著增加(P<0.01),Smad3蛋白的相对表达量增加(P<0.05或P<0.01),Smad7蛋白无明显改变(P>0.05);同时100μg/LTGF-β1作用12h后,细胞增殖率显著增加,Smad3蛋白相对表达量增加(P<0.05或P<0.01),Smad7蛋白表达无改变(P>0.05)。结论:外源性TGF-β1能够促进绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖,具有良好的浓度效应和时间效应;绒毛膜癌JEG-3细胞逃逸TGF-β1介导的生长抑制作用,可能是由于TGF-β1/Smads信号通路中的Smad3、Smad7蛋白发生异常而致。

靶向大鼠Smad3基因的siRNA筛选及其shRNA重组慢病毒的构建

目的设计并筛选针对大鼠Smad3基因的siRNA,构建靶向Smad3基因的shRNA重组慢病毒。方法针对大鼠Smad3基因设计并合成6对siRNA(siRNA001～006)及1对无关对照siRNA,转染大鼠肝细胞株BRL-3A,应用Western Blot检测各siRNA对SMAD3蛋白表达的抑制作用,挑选抑制效率高的siRNA。依据所得的序列合成并克隆到pLL3.7载体中,与包装质粒pRSV-rev、pMDLg-pRRE和VSV-G共转染293FT细胞获得靶向Smad3的慢病毒。通过流式细胞仪绿色荧光蛋白(GFP)荧光计数来检测病毒滴度。结果 Western Blot检测证实siRNA001、siRNA005、siRNA006对SMAD3蛋白表达的抑制作用明显,抑制率分别可达83.36%、86.99%及64.88%,而对照siRNA无明显作用。酶切和测序结果显示Smad3 shRNA及对照shRNA重组载体质粒pLL3.7-shRNA构建成功,将构建的质粒进行慢病毒包装可产生有感染活性的慢病毒颗粒。结论筛选出针对大鼠Smad3基因有明显抑制作用的3对siRNA,并成功构建表达相应shRNA的4种重组慢病毒,为研究调控Smad3的表达对肝再生或肝纤维化的影响提供了实验条件。

Smad7,Smad3和Smad2在DEHP诱导的尿道下裂大鼠阴茎中的表达

目的研究Smads(7,3和2)在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,(DEHP)]诱导的尿道下裂大鼠阴茎组织中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制。方法将SD孕鼠随机分为2组:实验组(将DEHP溶于1.5 mL大豆油中灌胃大鼠)和对照组(以1.5 mL大豆油灌胃大鼠),每组20只,自孕12 d(gestation day,GD12)至19 d(GD19)连续每天定时给药1次。至GD20行剖宫产取出雄性胎鼠,切取阴茎组织,采用实时定量PCR和免疫组化法分别检测胎鼠阴茎中Smad7,Smad3和Smad2三者mRNA和蛋白质表达水平。结果经qP CR检测分析后发现,Samd7,Smad3和Smad2三者mRNA在正常对照组相对于内参GAPDH的表达分别是1.00,0.84和1.14,在DEHP暴露组其相对表达分别是1.87,1.36和1.49,且三者在实验组的表达与正常对照组比较,均升高(P值分别为<0.001,0.041和0.021);观察实验组Smad7和p-Smad2/3蛋白表达水平亦有增加趋势。结论DEHP诱导的先天性尿道下裂可能与胎鼠阴茎组织中Smads(7,3和2)的过度表达有关。

再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞转化生长因子β1及Smad3表达下调的发病学意义

目的研究骨髓间充质干细胞(MSC)中转化生长因子β1(TGF-β1)与Smad3的表达下调与再生障碍性贫血(再障)发生的可能关系。方法取20例重型再障患者骨髓MSC,分离制备出Flk1+CD34–MSC后进行以下试验:①体外定向诱导MSC向脂肪细胞分化,倒置显微镜观察成脂分化情况,油红O染色法鉴定脂肪细胞,用实时荧光定量PCR检测分化过程中脂蛋白酯酶(LPL)基因的表达;②用蛋白质印迹法检测MSC中TGF-β1及Smad3的表达,用ELISA检测MSC分泌TGF-β1的能力;③观察不同剂量(0、5、10、15、20ng/ml)TGF-β1对再障患者骨髓MSC成脂分化和增殖的影响。以7名健康成人的骨髓MSC相应检测为对照。结果再障患者骨髓MSC经4d培养后即分化为脂肪细胞,而健康成人骨髓MSC中仅见少量细胞出现脂肪滴。再障患者MSC培养4和8d时LPL基因表达水平分别为0.091±0.028、0.142±0.033,均高于健康成人骨髓MSC(分别为0.021±0.011及0.049±0.010,均P<0.01);而TGF-β1及Smad3表达水平明显低于健康成人骨髓MSC,TGF-β1分泌水平(3.4μg/L±0.9μg/L)也明显低于健康成人骨髓MSC(11.6μg/L±1.2μg/L,P<0.01)。在向脂肪细胞分化过程中,仅加入5ng/ml的TGF-β1即可明显抑制再障患者骨髓MSC向脂肪细胞定向诱导分化,同时促进其增殖。结论再障患者骨髓MSC中TGF-β1及Smad3表达水平的显著下调可能参与了再障的部分发病环节。

荔枝核总黄酮对肝纤维化大鼠TGF-β1及Smad3、7表达的影响

目的探讨荔枝核总黄酮(TFL)对胆汁性肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、7表达的影响及其抗肝纤维化可能的作用机制。方法将雄性SD大鼠70只随机分为假手术组、模型组、TFL大剂量组[200mg/(kg.d)]和TFL小剂量组[100mg/(kg.d)]。采用胆总管结扎制备肝纤维化大鼠模型。分别于术后第2、3、4周处死大鼠,留取肝脏组织。HE染色观察大鼠肝组织病理改变;免疫组织化学法检测TGF-β1、Smad3、7在肝组织内的动态表达。结果假手术组肝组织内TGF-β1、Smad3有少量表达,Smad7呈高表达。与模型组比较,TFL大剂量治疗后大鼠肝组织内纤维化程度降低。随着肝纤维化的形成和发展,第2、3、4周TFL大剂量组大鼠肝组织TGF-β1(3.000±1.309、2.000±1.309、1.800±1.649)、Smad3(2.875±1.458、2.000±1.309、1.833±0.753)与模型组TGF-β1(3.750±1.488、4.333±1.211、5.000±0.817)、Smad3(3.375±0.916、4.000±0.894、4.250±0.500)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TFL能有效地减轻胆总管结扎所致肝纤维化大鼠肝损伤及肝纤维化程度,其机制可能与抑制TGF-β1、Smad3高表达,上调Smad7表达有关。

GSK3β促进TGF-β1诱导的肾小管上皮HK-2细胞纤维化

目的阐明GSK3β对于肾脏小管间质纤维化的作用。方法以TGF-β1诱导的体外肾小管间质纤维化模型为研究对象,以GSK3β特异抑制剂LiCl处理细胞和不同GSK3β表达质粒(野生型GSK3β表达质粒GSK3β-WT;第9位点上丝氨酸突变为丙氨酸,由此不能再被磷酸化失活而具有固有活性的GSK3β突变质粒GSK3β-S9A;第85、86位点上赖氨酸突变为丙氨酸、失去激酶活性的GSK3β突变质粒GSK3β-KD)转染细胞,观察肾脏纤维化的标志性分子纤维连接素蛋白(fibronectin,FN)表达水平的改变,以及对TGF-β/Smad信号通路的作用。结果 LiCl增加HK-2细胞GSK3β的磷酸化,抑制GSK3β的活性,同时降低了细胞基础水平和TGF-β1诱导的FN表达。过表达的GSK3β-WT增强TGF-β1诱导的FN表达,而这种效应在GSK3β-S9A转染细胞更为显著。过表达GSK3β-KD抑制TGF-β1诱导的FN表达。分析对TGF-β/Smad信号通路的作用,LiCl可以抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化,而对Smad2磷酸化水平无影响。同时,LiCl也不改变Smad3的总蛋白表达。结论 GSK3β通过TGF-β1/Smad3信号通路促HK-2细胞纤维化,抑制GSK3β可以抗纤维化。

Lefty蛋白拮抗人肾小管上皮细胞凋亡的研究

目的 探讨Lefty蛋白对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡的影响。方法采用脂质体将人Lefty质粒转染入离体培养的HK-2细胞，使其稳定表达Lefty蛋白。对正常对照组（A组）和Lefty转染组（B组）细胞给予10ng／mlTGF-β1刺激后，采用Westernblot法检测各组细胞第6、12、24、48小时磷酸化Smad2／3（p-Smad2／3）表达水平，并同时采用流式细胞术检测各组细胞凋亡程度。结果TGF131刺激后，A组p-Smad2／3表达水平和细胞凋亡程度较刺激前升高（P〈0．05），而B组上述指标均低于A组（P〈0.05）。结论Lefty蛋白可拮抗TGF-19J／Smad信号转导通路，减轻TGF-β1介导的人肾小管上皮细胞凋亡。

1,25(OH)_2D_3对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制

背景:脂肪间充质干细胞具有促进创伤修复的作用,但其分泌的Ⅰ型胶原会促进瘢痕形成,因此,寻找抑制脂肪间充质干细胞分泌胶原的方法将进一步增强其应用价值。目的:观察1,25(OH)_2D_3对脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及其作用机制。方法:(1)利用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞,将第4代脂肪间充质干细胞分别培养在含不同浓度(10^(-7),10^(-8),10^(-9),10^(-10),0 mol/L)1,25(OH)_2D_3的DMEM/F12培养基中干预4 d,收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平;(2)选取1,25(OH)_2D_3抑制Ⅰ型胶原分泌作用最明显的浓度对脂肪间充质干细胞进行干预,通过Real-time PCR检测1,25(OH)_2D_3干预前后细胞内Smad3的mRNA表达,Western blot检测1,25(OH)_2D_3干预前后细胞内Smad3总蛋白和磷酸化蛋白表达;(3)在1,25(OH)_2D_3干预基础上加入SMAD3抑制剂SIS3对脂肪间充质干细胞进行干预,4 d后收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平,以分析Smad3信号通路在其中的作用。结果与结论:(1)1,25(OH)_2D_3对人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响表现为剂量依赖性抑制作用;(2)Real-time PCR和Western blot结果显示1,25(OH)_2D_3干预后Smad3表达水平有一定升高;Western blot结果显示磷酸化Smad3蛋白含量显著升高;(3)Smad3抑制剂可阻断1,25(OH)_2D_3对Ⅰ型胶原分泌的抑制作用;(4)这些结果表明,1,25(OH)_2D_3可能通过上调Smad3的表达及活性来抑制人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原。

SnoN蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表达及其意义

目的:动态观察核转录共抑制因子SnoN蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表达变化,探讨其在糖尿病肾病(DN)发病机制中的作用。方法:SD大鼠随机分为3组,分别为糖尿病2周(DM2)、4周(DM4)和8周(DM8)组,每组均设相应的正常对照,链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病大鼠模型;免疫组织化学法检测肾组织中SnoN、TGF-β1、Smad2/3、APC的表达;Western印迹法检测肾皮质SnoN蛋白的水平;生化方法测定血糖、血肌酐及24h尿蛋白量;光镜检查肾组织的形态改变。结果:Western印迹和免疫组化检测发现DM2大鼠肾组织中SnoN的表达与正常组相比差异无显著,DM4组明显减少(P<0.01),至8周时减少为正常对照组的42%。DM2组,大鼠肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad2/3、APC较正常组显著增多,并随病程进展而增加(P<0.01);DM4和DM8组,SnoN蛋白表达的减少与TGF-β1、Smad2/3、APC表达增多呈显著负相关(P<0.01)。结论:糖尿病大鼠肾脏TGF-β1表达增多,可能通过APC依赖的泛素化作用使SnoN蛋白降解,从而在DN的发病机制中起重要作用。

2型糖尿病肾病患者尿中smad3蛋白的水平变化和意义

目的 探讨2型糖尿病患者尿中smad3蛋白水平变化在糖尿病肾病（DN）中的意义及其与DN进展的相关性。方法选取上海交通大学附属第六人民医院内分泌代谢科2010年5月至2011年8月收治的282例2型糖尿病患者和100名健康对照者，并根据尿标本白蛋白与肌酐比率（UACR），将患者分为正常白蛋白尿组（NA组）110例、微量白蛋白尿组（MA组）114例、大量白蛋白尿组即DN组58例。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测尿中smad3水平。同时测定人体参数及相关生化指标包括年龄、血压、体质指数（BMI）、血糖、血脂、尿白蛋白／肌酐（UACR）、肾小球滤过率估计值（eGFR）、糖化血红蛋白等，糖尿病视网膜病变（DR）根据免散瞳眼底照相结果进行评估，将58例DN患者分为不伴DR组（25例）和伴DR组（33例）。结果（1）2型糖尿病组尿smad3的水平显著高于对照组[489（273，1193）比311（179，497）ng／mmolCr，P〈0．01]。（2）按照UACR将2型糖尿病组再分为3组比较尿smad3水平，MA组与NA组相比、DN组与NA组相比、DN组与MA组相比，差异均有统计学意义[552（316，1338）比317（200，594）、1035（503，3035）比317（200，594）、1035（503，3035）比552（316，1338），均P〈0．01]。（3）Pearson相关分析表明尿smad3水平与年龄、收缩压、糖化血红蛋白、尿素氮、肌酐、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、eGFR及UACR显著相关，多元回归分析发现UACR是尿smad3的独立决定因子（p=0．754，P〈0．01）。（4）DN合并DR组尿smad3水平显著高于未合并DR组[1905（806，4303）比595（331，1183），P〈0．01]；DN合并DR组UACR水平与未合并DR组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论2型DN患者尿中smad3水平显著增加，并与ACR显著相关，提示尿smad3有可能作为诊断DN的一个标志物，并可预测DN的严重程度。

光动力疗法对增生性瘢痕成纤维细胞中Smad3蛋白磷酸化的影响

目的探讨增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）经过光敏剂血卟啉单甲醚（HMME）诱导，Smad3蛋白在光动力疗法（PDT）中的磷酸化效应。方法将原代培养的HSF分为对照组、PDT组、单纯光敏剂（PS）组和单纯（Laser）激光照射组，经Smad3-FITC染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Smad3的荧光强度；收集各组细胞经Western印迹法检测Smad3和磷酸化Smad3蛋白的含量。结果在荧光显微镜下观察到各组总体荧光强度相近，但与对照组核内荧光聚集较明显相比，PDT组HSF核内荧光微弱；HSF中磷酸化Smad3蛋白经PDT治疗后含量降低，与对照组相比，二者差异有统计学意义（0．92±0．15比0．20±0．02，P〈0．05），PS组和Laser组中磷酸化Smad3蛋白表达，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PDT能够降低Smad3蛋白磷酸化水平，从而抑制HSF增殖。

哺乳类雷帕霉素靶蛋白信号通路对柯萨奇病毒B3诱导的心肌成纤维细胞Smad3蛋白和Ⅰ型胶原表达调控的实验研究

目的探讨哺乳类雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路对柯萨奇病毒B3（CVB3）诱导的心肌成纤维细胞Smad3蛋白（Smad3）和Ⅰ型胶原表达的调控作用。方法CVB3感染原代培养的SD鼠心肌成纤维细胞，用mTOR的抑制剂—雷帕霉素阻断mTOR信号通路，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot方法检测细胞Smad3和Ⅰ型胶原表达。结果（1）雷帕霉素干预心肌成纤维细胞48h，RT—PCR检测mTOR／β-肌动蛋白（actin）光密度值分别为1nmol/L组0．381±0．022、10nmol/L组0．282±0．014、100nmol/L组0．263±0．012，均低于对照组1．45±0．04，10nmol/L组和100nmol/L组低于1nmol/L组，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。10nmol/L雷帕霉素干预心肌成纤维细胞0h（对照组）、24h．48h、72h，其mTOR／β-actin光密度值分别为0．341±0．022、0．203±0．021、0．163±0．022、0．144±0．013，光密度值随雷帕霉素干预时间的延长而降低（P〈0．05）。（2）RT-PCR和Westernblot测得对照组、CVB3组、CVB3＋雷帕霉素组心肌成纤维细胞Smad3／β-actin光密度值分别为0．63±0．06、1．18±0．03、0．77±0．08，Smad3／β-actin灰度值分别为0．89±0．07、2．27±0．13、0．131±0．013。RT—PCR测得上述各组Ⅰ型胶原／B—actin光密度值分别为1．13±0．06、1．303±0．012、0．82±0．03。以上结果显示CVB3组光密度值／灰度值高于对照组，CVB3＋雷帕霉素组低于CVB3组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论雷帕霉素抑制CVB3诱导的心肌成纤维细胞Smad3和Ⅰ型胶原表达，提示mTOR信号通路可能通过调控Smad及Ⅰ型胶原表达，在CVB3诱导的心肌纤维化过程中起重要作用。

硫氧还蛋白通过Smad3／AP-1通路抑制人血管内皮细胞黏附蛋白的表达

目的 研究硫氧还蛋白（Trx）在动脉粥样硬化中对血管内皮细胞保护作用的分子机制. 方法 应用腺病毒感染的方法在原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中建立过表达硫氧还蛋白及其对照的细胞模型.以致动脉粥样硬化重要危险因子氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）为刺激剂.应用免疫印迹及间接免疫荧光法检测Trx,黏附分子（ICAM-1,VCAM-1）及其上游信号分子（Smad3,AP-1）的蛋白表达及细胞定位.应用胰岛素还原法检测Trx的活性,应用荧光探针DCFHDA进行细胞内活性氧检测. 结果 和对照组相比过表达Trx组Trx表达量明显提高,活性检测显示Ad-Trx的活性上调率为（26.2±3.3）％,细胞内活性氧（ROS）检测提示过表达Trx显著抑制细胞内ROS的产生.和对照组相比在基础及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激下过表达Trx组明显下调了内皮细胞黏附分子的表达（P＜0.05）,显著提高了内皮细胞中Smad3的磷酸化（P＜0.05）.而应用Smad3磷酸化特异性的抑制剂SIS3预处理细胞反转了Trx对黏附蛋白的抑制作用.SIS3预处理细胞进一步上调了oxLDL刺激下AP-1亚基c-Fos的核蛋白表达. 结论 Trx抑制内皮细胞黏附分子表达的作用可能是通过上调Smad3蛋白的磷酸化及抑制核转录因子AP-1亚基c-Fos的核表达来调节的.

麝香保心丸联合达格列净对心力衰竭大鼠肾脏纤维化的影响

目的 探讨麝香保心丸和达格列净对心力衰竭大鼠肾脏纤维化的影响。方法 将Wistar雄性大鼠分为对照组(n=8)、模型组(n=9)、麝香保心丸组(n=8)、达格列净组(n=8)和麝香保心丸+达格列净组(n=8)。模型组及各药物组大鼠予以腹腔注射阿霉素制备心力衰竭模型,造模后各药物组分别给予相应药物灌胃。采用HE染色法观察大鼠肾脏组织病理学变化,Masson染色法观察肾脏纤维化情况并以胶原容积分数(CVF)评估胶原沉积情况;Western blotting法检测大鼠肾脏组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3及Smad7蛋白表达情况。结果 模型组肾脏组织CVF高于对照组(P<0.01);各治疗组肾脏组织CVF低于模型组,且麝香保心丸+达格列净组低于麝香保心丸组、达格列净组(P<0.01)。与对照组比较,模型组较多炎性细胞浸润,肾脏纤维化显著,TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达明显增加,Smad7蛋白表达下降(P<0.01);与模型组比较,麝香保心丸组、达格列净组及麝香保心丸+达格列净组肾脏纤维化程度减轻,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平下降,Smad7蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论 麝香保心丸和达格列净通过调控TGF-β1/Smads信号通路达到抗心力衰竭大鼠肾脏纤维化的作用,且两药联用效果优于单一用药。

MicroRNA-21在单侧输尿管梗阻大鼠间质纤维化肾脏组织中的表达及意义

目的观察MicroRNA-21(miRNA-21)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏组织中的表达,初步探讨其在转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3致大鼠肾间质纤维化(RIF)信号通路中的机制。方法选择20只SD雄性大鼠,分为UUO组和假手术组(Sham组),分别于建模后第3天、第7天各采集每组5只大鼠肾脏组织,应用实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法检测肾脏组织中miRNA-21的表达变化,采用Masson染色、苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学技术评价肾组织纤维化,使用免疫组织化学检测肾脏组织中TGF-β1、Smad3、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况。结果建模后第3天和第7天UUO组肾脏组织中miRNA-21与Sham组比较均升高(P<0.01),7dUUO组肾组织中miRNA-21与3dUUO组相比升高(P<0.01)。建模后3、7dUUO组Masson染色纤维化评分、TGF-β1、Samd3、α-SMA及Col-Ⅰ蛋白阳性表达面积较Sham组升高(P<0.01),以上指标7dUUO组较3dUUO组比较表达增强(P<0.01)。UUO组肾组织中miRNA-21的表达与肾间质纤维化评分正相关(r=0.888,P<0.01);肾组织miRNA-21与TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达呈正相关(r=0.799、0.849、0.882、0.896,P<0.01)。结论 UUO大鼠肾组织中miRNA-21在建模后表达上调,且间质纤维化程度越重表达越高,TGF-β1/Smad3信号通路可能是通过上调miRNA-21从而介导大鼠肾间质纤维化。

人促红细胞生成素对大鼠急性创面转化生长因子β1／Smad3信号转导通路的影响

目的探究人促红细胞生成素（hEPO）对大鼠急性创面愈合相关转化生长因子β1（TGF－β1）/Smad3信号转导通路的影响。方法选取72只健康SD大鼠，在大鼠背部制成直径约2.5 cm的圆形急性创面，按随机数字表法将大鼠分为生理盐水对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组18只。4组大鼠每日常规清创后，生理盐水对照组大鼠创面予1 mL生理盐水浸润的纱布外敷，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面每天分别予1 mL 50、100、150 U的hEPO浸润的纱布湿敷，再用6层干纱布包扎固定，每天换药1次。治疗3、7、14 d每组取6只大鼠行大体观察并计算创面愈合率，处死后取创面组织采用免疫组织化学法观察CD31和TGF－β1的表达，蛋白质印迹法检测3只大鼠磷酸化Smad3蛋白的表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验、Bonferroni校正。结果（1）治疗3 d，4组大鼠创面均有明显的渗出并有结痂。治疗7 d，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面均较生理盐水对照组明显缩小。治疗14 d，4组大鼠创面均全部愈合。治疗7 d，与生理盐水对照组相比，中剂量组、高剂量组大鼠创面愈合率明显增加（P〈0.01）；余时间点，各组大鼠创面愈合率相近（P〉0.05）。（2）CD31主要定位在血管上。除低剂量组治疗3、7 d（P〉0.05）外，低剂量组大鼠治疗14 d和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14 d创面组织中CD31表达均明显高于生理盐水对照组（P〈0.01）；除治疗3 d（P〉0.05）外，中剂量组和高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达均明显高于低剂量组（P〈0.01）；除治疗3 d（P〉0.05）外，高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达明显高于中剂量组（P〈0.01）。（3）除低剂量组治疗3 d（1.9±0.7，P〉0.05）外，低剂量组大鼠治疗7、14 d（3.3±1.0、3.7±0.7）和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14 d创面组织中TGF－β1表达（3.3±1.0、3.6±1.0、3.9±0.9，3.4±0.7、3.8±0.8、4.2±0.4）均明显高于生理盐水对照组（1.7±0.5、2.7±1.0、3.0±0.9，P〈0.01）；除治疗7 d（P〉0.05）外，中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、14 d创面组织中TGF－β1表达均明显高于低剂量组（P〈0.01）；除治疗14 d（P〈0.01）外，高剂量组大鼠治疗3、7 d创面组织中TGF－β1表达与中剂量组相近（P〉0.05）。（4）除低剂量组治疗3、14 d及中剂量组和高剂量组治疗14 d（P〉0.05）外，3组大鼠余时间点创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于生理盐水对照组（P〈0.01）；除治疗14 d（P〉0.05）外，中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、7 d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于低剂量组（P〈0.01）；除治疗14 d（P〉0.05）外，高剂量组大鼠治疗3、7 d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显低于中剂量组（P〈0.01）。结论外源性hEPO可提高大鼠急性创面CD31、TGF－β1、磷酸化Smad3的表达，促进创面血管新生，激活TGF－β1/Smad3信号转导通路促进创面愈合。