肺癌患者外周血和胸腔积液T细胞受体组库特征分析

目的 比较肺癌患者外周血和胸腔积液的T细胞受体(TCR)组库的免疫学特征。方法 收集2020年7月至2021年1月在复旦大学附属中山医院就诊的5例合并恶性胸腔积液肺癌患者的外周血和胸腔积液,分离外周血单个核细胞(PBMC)和胸腔积液单个核细胞(PEMC),提取基因组DNA,采用Illumina MiSeq平台对TCR进行高通量测序,分析TCR组库的多样性等特征。结果 PBMC和PEMC中的TCR克隆型、VJ pairs和互补决定区3(CDR3)序列的多样性和相关性差异均无统计学意义。PBMC中检测到的TCR克隆数量高于PEMC(P<0.05),VJ pairs和CDR3数量与PEMC差异无统计学意义。PBMC和PEMC配对样本的共有VJ pairs数量占总VJ pairs的比例高于共有克隆型和CDR3序列的数量比例(P<0.05),后两者差异无统计学意义。PEMC中高扩增克隆(HEC)数量和占比均高于PBMC。同时鉴定了36个在PBMC和PEMC中差异表达的VJ pairs,其中25个在PEMC中表达升高、9个在PEMC中表达降低。结论 肺癌患者外周血和胸腔积液的TCR组库表现出不同的特征性变化,可能为肺癌重要的免疫病理学特征。

基于免疫组库测序的肝硬化典型证候患者外周血T细胞受体β链CDR3多样性分析

目的 本研究通过免疫组库测序,分析肝硬化不同典型证候患者外周血TCR β链CDR3的多样性,探讨肝硬化证候的物质基础及其规律。方法 20例肝硬化患者为病例组,包括肝胆湿热(LGHD)、肝郁脾虚(LDSD)、肝肾阴虚(LKYD)3种证型,10例健康患者为正常对照组。从外周血样品中提取DNA,对TCRβ链CDR3进行多重PCR扩增,然后对产物进行高通量测序,分析其TCR β链CDR3的多样性。结果 肝硬化证候LDSD的CDR3独有nt序列数与CDR3独有aa序列数均少于LKYD(P<0.05);LGHD和LKYD的Clonality、Pielous、Shannon.Index和DE50具有显著性差异(P<0.05);3种证型的V和J区基因中多个片段使用频率及V-J基因重组有显著性差异:在LGHD和LDSD中,TRBV21-1、TRBV12-4、TRBV11-1亚型及7对V-J重组有统计学差异(P<0.05);在LGHD和LKYD中,TRBV10-2、TRBV7-6、TRBV5-8亚型及30对V-J重组有统计学差异(P<0.05);在LDSD和LKYD中,TRBJ1-5亚型及18对V-J重组有统计学差异(P<0.05)。结论本研究通过挖掘肝硬化不同证候的免疫学特征,发现肝硬化证候TCR CDR3的多样性具有显著差异且符合由实向虚的证型变化规律,为寻找“病证结合”“辨证论治”的客观依据提供新的支撑,以期发现肝硬化不同证候人群适应性免疫基因重排的表达差异和特异性标记。

结直肠癌类器官的反应性T细胞受体筛选及功能鉴定

目的本研究通过建立基于结直肠癌(colorectal cancer,CRC)类器官模型以及CRC反应性肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)扩增和分离,筛选肿瘤特异性T细胞受体(T cell receptor,TCR)并进行功能验证,为结直肠癌个体化过继性T细胞免疫治疗的临床转化提供技术平台和研究基础。方法通过体外3D培养技术构建结肠癌患者组织来源的类器官模型,并利用HE染色和免疫组化进行形态学和特征分子表达检测。随后,将CRC类器官与TIL共培养,通过流式细胞技术分选反应性TIL,通过单个T细胞受体基因克隆技术分析反应性TCR克隆特征。进一步通过细胞毒性实验对TCR功能进行验证。结果通过形态学、代表性分子(CK20和CDX2)表达水平验证了结直肠癌类器官与患者肿瘤具有高度相似性。成功筛选到CD137表达上调和IFN-γ分泌增加的结直肠癌反应性T细胞,其中TCR2-T展现出较好的肿瘤反应性和体外肿瘤杀伤功能。结论建立了基于CRC-Org的反应性TCR筛选和功能验证平台,为结直肠癌个体化T细胞治疗转化应用提供技术平台。

肿瘤精准靶向免疫治疗的关键:T细胞受体抗原筛选技术

过继性T细胞疗法在实体瘤治疗中展现了良好的前景,成为目前肿瘤治疗领域的一大研究热点。其中,TCR-T疗法主要通过T细胞受体(TCR)与抗原肽-主要组织相容性复合体(pMHC)的特异性识别,进而激活过继性T细胞的抗肿瘤免疫反应。因此,全面解析TCR所靶向的抗原信息有助于提高TCR-T疗法在临床应用中的有效性及安全性。然而,高效、高通量的TCR抗原筛选技术的缺乏限制了TCR-T疗法的发展。近年来,随着高通量测序技术、质谱流式细胞技术和计算生物学的快速发展,研究人员开发了多种TCR抗原筛选技术用于解析TCR及其特异性识别的抗原信息。本文从抗原定向筛选、TCR定向筛选以及双向筛选三方面对TCR抗原筛选技术进行归纳总结,系统介绍其优缺点,展望TCR抗原筛选技术领域的发展前景,为未来抗原筛选技术的开发提供了新思路。

单细胞测序分析病毒性肺炎患者T细胞受体基因差异

目的:采用单细胞测序分析病毒性肺炎患者外周血T细胞受体(TCR)基因差异,探讨可能发病机制。方法:利用NCBI数据库获得数据,设置病例组和对照组进行实验。使用RStudio软件R语言分析单细胞测序数据,绘制表格和图片,得出结论。结果:病例组和对照组TCR有显著差异。对TCRα链和β链V、J基因片段使用频率进行分析,其中病例组TRAV1-2、TRAV29/DV5、TRAJ33、TRAJ48、TRBV20-1、TRBV2、TRBJ2-3、TRBJ1-1等基因使用频率明显高于对照组(P<0.05)。进一步V-J基因组合分析显示,病例组α链V-J对使用频率最高的是TRAV1-2-J33,β链V-J使用频率最高的是TRBV20-1-J2-1,αβ双链V-J使用频率最高的是TRAV30-J24-TRBV3-1-J2-7。结论:病毒性肺炎患者外周血TCR基因发生了明显改变,可能与病毒免疫发病机制有关。

高通量测序揭示原发性胆汁性胆管炎患者的T细胞受体图谱特征

目的揭示原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)患者T细胞受体(T cell receptor,TCR)图谱特征,并揭示大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)抗原在PBC疾病的分子模拟机制。方法采用多重聚合酶链反应和免疫组库测序技术分析PBC患者和健康对照者的CD4^(+)和CD8^(+)记忆性TCRβ链互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)序列的多样性、氨基酸组成及疏水性、共有CDR3序列。体外诱导和扩增人PDC-E2_(163-176)(人PDC-E2)抗原相关T细胞和E.coli PDC-E2_(31-44/134-147/235-248)(E.coli PDC-E2)抗原相关T细胞,通过免疫组库测序技术鉴定人(和E.coli)PDC-E2抗原相关TCRβCDR3图谱,并分析其丰度变化。结果PBC患者组和健康对照组间的CD4^(+)记忆性T细胞、CD8^(+)记忆性T细胞TCRβCDR3免疫图谱多样性相似,D50指数[CD4^(+)记忆性T细胞:0.028±0.019比0.034±0.015;CD8^(+)记忆性T细胞:(1.86±2.70)×10^(-3)比(4.62±3.89)×10^(-4)]、Shannon指数(CD4^(+)记忆性T细胞:9.473±1.346比9.734±0.933;CD8^(+)记忆性T细胞:6.197±1.519比5.436±1.629)、Gini指数(CD4^(+)记忆性T细胞:0.786±0.048比0.760±0.036;CD8^(+)记忆性T细胞:0.920±0.047比0.939±0.025)等差异均无统计学意义(P均>0.05)。PBC组和健康对照组CD4^(+)记忆性T细胞和CD8^(+)记忆性T细胞间共有CDR3序列百分比差异无统计学意义[(6.47±1.43)%比(6.21±3.18)%;t=-0.21,P=0.84]。健康对照组和PBC组中序列长度为13、14、15的CDR3分子第6位和第7位氨基酸的组成频率中部分存在显著差异,疏水氨基酸组成频率近似。通过细胞培养和免疫组库测序鉴定了一系列人PDC-E2和E.coli PDC-E2抗原刺激后丰度显著上升的TCR序列。结论该研究鉴定出PBC疾病的TCR图谱特征,从TCR这个新视角阐述了E.coli在PBC疾病中的分子模拟机制。

T细胞受体Dβ-Jβ sjTRECs连接区多样性

目的 了解T细胞受体Dβ Jβ重排形成的T细胞受体删除DNA环 (sjTRECs)连接区序列特点。 方法 利用巢式PCR分别扩增 10例正常人外周血单个核细胞和 3例正常胸腺细胞DNA中不同的Dβ片段和Jβ重排时形成的TRECs的情况 ,PCR产物进一步进行克隆和序列分析以确定结合区的序列。结果 获得Dβ1与 5个Jβ1基因片段、Dβ2与 4个Jβ2基因片段分别形成的sjTRECs连接区序列 ,部分所形成sjTRECs的Jβ与Dβ之间存在核苷酸的随机插入 (N区 )等多样性。结论 Dβ JβsjTRECs的连接并非简单的头对头拼接方式 。

自身免疫性疾病的T细胞受体研究及应用进展

自 2 0世纪 80年代T细胞受体基因先后被克隆 ,近年来T细胞受体与自身免疫性疾病的关系得到广泛研究。在此基础上产生的T细胞疫苗、T细胞受体肽疫苗及核酸疫苗作为治疗自身免疫病的新方法 。

胸腺输出功能的评价手段—T细胞受体重排删除环的定量分析

多年来 ,因缺乏合适的检测胸腺输出naiveT细胞的技术 ,未能明确胸腺输出功能。由于胸腺T细胞的分化始于T细胞受体 (TCR)基因的重排 ,在TCRα基因重排时 ,通过δRec和 ψJα基因片段重组形成染色体外DNA环而删除TCRδ基因 ,该删除环称为信号结合T细胞受体重排删除环 (sjTRECS)或TRECs。TRECs十分稳定 ,不扩增且随着细胞增殖而稀释 ,故近期研究认为对TRECs的定量检测可以直接地估计胸腺的输出功能。本文综述了TRECs定量分析在评价正常人和造血干细胞移植 ,血液肿瘤、HIV感染和自身免疫性疾病等等的胸腺输出功能中的作用。

和解汤对慢性乙型肝炎T细胞受体Vβ7基因表达的影响

目的:探讨和解汤对慢性乙型肝炎（简称慢乙肝）临床疗效与T细胞受体Vβ7（TCRVβ7）基因表达特征的相关性。方法:将慢乙肝患者45例随机分为两组,治疗组（30例）采用和解汤治疗,对照组（15例）采用常规西药治疗,观察治疗后TCRVβ7,基因表达变化。结果:经过6个月治疗,两组ALT水平均显著下降（P<0.01）,治疗组5例测出TCRVβ7,基因表达,并均出现HBV-DNA、HBeAg阴转;对照组无一例测出TCRVβ7基因表达,无一例出现HBV-DNA、HBeAg阴转。HBV-DNA、HBeAg未阴转的患者,虽肝功能恢复正常,但无一例测出TCRVβ7基因表达。两组总有效率比较差异无显著性,但两组显效率比较差异有显著性（P<0.01）。结论:和解汤对TCRVβ7基因表达有调节作用,可能是抑制病毒复制、清除病毒的重要途径。

再生障碍性贫血T细胞受体Vβ基因表达及生血合剂对其的干预作用

目的 利用免疫学和分子生物学技术，着重从T细胞受体β链可变区（TCR Vβ）亚家族基因表达角度探讨再生障碍性贫血（AA）的免疫发病机制及中药复方生血合剂的治疗作用。方法 AA患者分别用生血合剂（治疗组10例）和环孢霉素（对照组10例）治疗6个月以上，采用RT-PCR、基因扫描方法检测治疗前后外周血单个核细胞TCR Vβ基因表达的变化。结果 20例AA患者Vβ24个亚家族基因谱型倾斜，寡克隆亚家族所占百分率明显增多，与健康人（10名）比较差异有显著性（P〈0．01）。30％～50％的AA患者存在Vβ2、Vβ5、Vβ6、Vβ15、Vβ16、Vβ22、Vβ23寡克隆亚家族，50％以上的患者存在Vβ8、Vβ21寡克隆亚家族。治疗后两组寡克隆亚家族均比治疗前减少（P〈0．05）。结论 多个克隆性增殖的T细胞家族参与了AA的发病过程，生血合剂可改善TCR Vβ谱型倾斜程度，降低异常T细胞克隆性增殖，从而减少异常克隆的T细胞对造血组织的免疫损伤，有利于骨髓造血功能的恢复。

马立克氏病强毒株感染鸡T细胞受体亚群动态变化的研究

为深入探讨鸡马立克氏病Ｔ细胞受体亚群的变化与疾病发生与发展的相互关系，本实验以马立克氏病强毒株人工感染１日龄ＳＰＦ雏鸡，在不同的感染期，以流式细胞仪分析脾脏、胸腺、外周血淋巴细胞中ＴＣＲ１＋和ＴＣＲ２＋Ｔ细胞的动态变化。结果表明，感染鸡脾脏中ＴＣＲ１＋Ｔ细胞异常增高，而ＴＣＲ２＋Ｔ细胞在脾脏和外周血中表现为暂短的升高，其后迅速下降。ＴＣＲ１＋Ｔ细胞与ＴＣＲ２＋Ｔ细胞的这种异常变化是ｖＭＤＶ感染雏鸡后Ｔ细胞表型变化的重要特征之一。

注射用甲泼尼龙琥珀酸钠静脉冲击治疗Graves眼病对T细胞受体的影响

目的通过对注射用甲泼尼龙琥珀酸钠静脉冲击治疗前后的Graves眼病(TAO)患者T细胞受体(TCR)进行测序,进一步探索注射用甲泼尼龙琥珀酸钠静脉冲击治疗TAO的免疫学机制,为新兴免疫学治疗提供理论依据。方法收集6例TAO患者,于诊断时、第1次冲击治疗结束时和第3次冲击治疗结束时的3个时间点采集外周血。提取外周血单个核细胞并提取RNA进行TCR免疫组库测序,后续进行高通量测序数据挖掘分析。结果3次激素冲击结束后,病情好转的TAO患者,其TCR多样性指数、VJ家族迁移、VJ家族频率变化差异无统计学意义。相反病情恶化的TAO患者,其高频VJ家族出现克隆扩增。TAO患者缓解伴随着Th17细胞的下降。结论注射用甲泼尼龙琥珀酸钠静脉冲击治疗TAO的机制是机体免疫平衡的重新建立,而不是自身反应性克隆的消除。

PCR-SSCP检测非霍奇金淋巴瘤患者骨髓克隆性T细胞受体基因重排及其临床意义

背景与目的:进一步了解非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma,NHL)患者骨髓标本克隆T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)基因重排情况及临床意义。方法:应用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)联合单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)分析43例NHL患者骨髓标本TCRVγI-Jγ基因重排情况。结果:43例NHL患者有26例(60.5%)存在克隆性TCRVγI-Jγ基因重排。16例骨髓形态学检查未发现淋巴瘤细胞浸润者中有3例(18.8%)发现克隆性TCRVγI-Jγ基因重排,此3例患者分别于4～9个月后行骨髓形态检查时发现淋巴瘤细胞浸润;27例骨髓形态学检查有淋巴瘤细胞浸润者有23例(85.2%)存在克隆性TCRVγI-Jγ基因重排阳性。26例PCR扩增阳性病例经SSCP分析发现7例(26.9%)存在寡/亚克隆重排。7例存在寡/亚克隆重排患者经3～11个月有5例(71.4%)发展为白血病,存在寡/亚克隆重排NHL患者1年内转化为白血病的发生率显著高于无寡/亚克隆重排患者(10.5%)(P<0.005)。结论:应用PCR检测NHL患者骨髓标本克隆性TCRVγI-Jγ基因重排可较骨髓形态学检查更早发现NHL患者骨髓浸润微小病灶。具有寡/亚克隆NHL患者更易发展为白血病,还可发展为急性非淋巴细胞白血病。

非小细胞肺癌患者T细胞受体Vβ表达和克隆性研究

目的 了解非小细胞肺癌 (non small celllungcancer ,NSCLC)患者外周血淋巴细胞 (PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)及非癌肺组织淋巴细胞中T细胞受体 (TCR)Vβ优势表达情况及优势亚家族的克隆性分布。方法 收集 2 4例NSCLC患者外周血、肺癌组织和非癌肺组织 ,提取RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR) ,扩增TCRVβ 2 4个亚家族基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经基因扫描分析 ,以 10例正常人外周血结果作对照 ,比较不同来源T细胞TCRVβ亚家族的表达情况。 结果 NSCLC患者仅存在部分亚家族的T细胞 ,其中TCRVβ5的表达率在TIL中 (6/18,33.3% )明显高于PBL(1/2 4,4.2 % )和非癌肺组织(0 /12 ) ,P值均 <0 .0 5 ,而且 6例表达Vβ5的TIL中 2例为寡克隆增殖 ,4例为多克隆增殖。 结论 NSCLC患者TCRVβ 2 4个亚家族呈倾斜性分布和克隆性增殖 ,提示NSCLC的TIL中可能存在肿瘤相关抗原 (TAA)

急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8^+ T细胞受体α和β链亚家族特点

目的:分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体α和β链亚家族特点。方法:从1例HLA*0201的急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用乙肝抗原HBsAg表位S335-343多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导CD8+ T增殖,用流式细胞仪分选出特异性CTL到96孔培养板,培养10～14 d后,提取细胞RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和TCR Vβ,并用非特异性CD8+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果:从HBV急性肝炎患者分离的HBsAg335-343表位特异性CD8+ T细胞扩增出15个Vα亚家族和10个Vβ亚家族,其中用少量CTL仅检出Vα2、Vα9和TCR Vβ3、Vβ4、Vβ9,提示这几种亚家族可能为该特异性CTL TCR的优势取用亚家族,除Vα2呈现3种序列和Vβ9呈现2种序列外,其他亚家族内序列单一;而从患者非特异性CD8+ T对照细胞中可扩增到所有的32个TCRVα和25个Vβ亚家族,且同一亚家族序列呈现高度多样性。结论:急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体存在优势利用的特点,可能是由于针对同一抗原的特异性CD8+ T细胞克隆性增殖所致,其机制有待进一步分析。

分化早期小儿急性白血病细胞免疫球蛋白和T细胞受体基因结构的变化

从29例免疫分型的小儿急性白血病中选出髓过氧化物酶染色阴性和不与细胞系相关或成熟细胞系相关的单克隆抗体反应的6例白血病细胞,进一步作免疫球蛋白(包括重链和κ轻链)和T细胞受体(包括δ、γ、β)基因结构的分析。所有6例均有IgH基因的重排,提示这些白血病细胞是β细胞来源。两例CD_(10)阴性和白病细胞.κ链基因没有重排,其中一例的TCRδ、γ、β基因也都处于胚系,另一例的TCRβ处于胚系。在CD_(10)阳性白血病细胞中,其中两例κ链基因丢失,TCR基因结构都有不同程度的变化(重排或丢失)。这些结果可能提示在CD_(10)阳性白血病细胞中能产生功能性IgH的重排,并可导致IgL和TCR基因结构的变化。

慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征患者外周血T细胞受体Vβ基因克隆性分析

目的检测慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征(CAP/CPPS)患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ1、Vβ8、Vβ11和Vβ20基因表达,了解TCRVβ克隆增殖与CAP/CPPS的关系。方法用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测36例CAP/CPPS患者和14例正常健康男性外周血TCRVβ1、Vβ8、Vβ11和Vβ20mRNA的表达,比较两组间的差异。结果两组TCRVβ1mRNA平均相对吸光度(A)值分别为(0.24±0.08)和(0.25±0.04),P>0.05;TCRVβ8分别为(0.26±0.07)和(0.28±0.03),P>0.05;TCRVβ11分别为(0.31±0.06)和(0.27±0.05),P>0.05;而CAP/CPPS患者外周血TCRVβ20mRNA平均相对吸光度(A)值明显高于正常对照组,分别为(0.62±0.11)和(0.29±0.04),P<0.05。结论CAP/CPPS患者外周血存在TCRVβ20优势克隆,提示自身免疫反应可能参与了CAP/CPPS的发病。

CD28协同刺激分子对T细胞受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响

目的:分析anti-TCRαβ mAb、anti-TCRαβ mAb+anti-CD28mAb诱导小鼠胸腺淋巴细胞不同亚群的凋亡及凋亡程度,分析CD28协同刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡 的影响。方法:新鲜分离胸腺细胞,加入anti-TCRαβ mAb、anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb等培养20 h,进行多重染色,流式细胞仪分析。结果:与胸腺细胞自发凋亡的结果相比较:①双信号刺激可明显增加胸腺细胞凋亡的数目,尤其是CD4+ CD8+胸腺细胞的凋亡数目。②凋亡的CD4+ CD8+亚群、CD4+ CD8-亚群细胞表面CD28的表达均增多。结论:CD28共刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响与细胞的成熟程度有关。CD28共刺激分子能明显增强不成熟皮质胸腺细胞的凋亡。

急性非淋巴细胞性白血病免疫球蛋白和T细胞受体基因重排的研究及其意义

采用PCR法对25例不同时期急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）患者免疫球蛋白重链（IgH）和T细胞受体γ链（TcRr）基因重排进行了研究。结果显示，3例（12．0％）发生IgH基因重排，3例（12．0％）出现TcRr基因重排，其中1例同时出现IgH和TcRr基因重排，对这种ANLL中序列失真现象的机制及其在白血病基因分型及检测微小残留疾病中的意义进行讨论。