Gabra3通过AKT/mTOR途径促进膀胱癌T24细胞侵袭和迁移

目的:探究γ-氨基丁酸受体亚基α-3(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-3,Gabra3)基因对膀胱癌T24细胞凋亡、迁移和侵袭的作用及其机制。方法:TCGA数据库分析Gabra3基因在膀胱癌中的表达以及转移和生存的相关性。建立Gabra3过表达和Gabra3突变的T24细胞株,根据转染质粒不同,分为空白T24细胞(Control)、空pDONR223载体转染T24细胞(NC)、野生型Gabra3过表达T24细胞株(wt-Gabra3)、突变型Gabra3 T24细胞株(mut-Gabra3)。在回补实验中,分为转染突变型Gabra3 T24组(mut-Gabra3)、转染空pDONR223载体mut-Gabra3组(mut-Gabra3-NC)、转染野生型Gabra3过表达组(mut-Gabra3+wt-Gabra3)。用TUNEL染色检测T24细胞凋亡,细胞划痕和Transwell分别检测T24细胞迁移和侵袭,Western blot检测AKT/mTOR通路相关分子生物表达水平。结果:Gabra3基因在膀胱癌中显著高表达(P<0.05),生存曲线证实远处转移存在的患者生存期明显较短(P<0.05)。成功构建Gabra3过表达和突变的T24细胞株。与Control组相比,wt-Gabra3组细胞凋亡能力显著降低,迁移、侵袭能力显著增强(P<0.05),而mut-Gabra3组细胞凋亡显著增加,侵袭能力显著减弱(P<0.05);wt-Gabra3组细胞p-AKT、p-mTOR、p-4E-BP1、p-S6K蛋白表达均显示上凋(P<0.05),而mut-Gabra3组细胞上述蛋白无差异。在回补实验中,过表达wt-Gabra3的mut-Gabra3突变T24细胞凋亡能力受到抑制(P<0.05),迁移和侵袭能力显著增强(P<0.05),并且该组细胞AKT/mTOR通路相关分子显著激活(P<0.05)。结论:外源性的未编辑的Gabra3可以促进膀胱癌T24细胞的迁移、侵袭能力,并且可能与激活AKT/mTOR途径通路密切相关。

醛缩酶A对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭的影响

目的探索醛缩酶A(ALDOA)过表达和基因敲减对膀胱癌T24细胞生长和侵袭的影响,为探讨泌尿系统肿瘤发病机制提供理论依据。方法通过慢病毒感染构建稳定表达的ALDOA过表达和基因敲减膀胱癌T24细胞重组细胞株,采用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测重组细胞ALDOAmRNA的表达情况;采用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell小室实验检测重组T24细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果RT-PCR检测结果显示,过表达组重组T24细胞ALDOAmRNA的相对表达量较对照组更高,基因敲减组较对照组更低,证实膀胱癌T24细胞重组细胞株构建成功;CCK-8法检测重组细胞增殖结果显示:在培养72、96 h时,过表达组重组T24细胞生存率均较对照组更高;在培养96 h时,基因敲减组T24细胞生存率较对照组更低;划痕愈合实验结果显示:在培养24 h时,过表达组重组T24细胞划痕愈合率较对照组更高;Transwell小室细胞实验结果显示:在培养48 h时,过表达组重组T24细胞迁移数较对照组更多,过表达组重组T24细胞侵袭数较对照组更多(均P<0.05);培养24 h时,基因敲减组重组T24细胞划痕愈合率较对照组更低;在培养48 h时,基因敲减组重组T24细胞迁移数较对照组更少,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论ALDOA过表达可促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭,ALDOA基因敲减可减少膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭。

基于基因表达芯片和实验验证葛根素降低膀胱尿路上皮癌T24细胞IL6表达及抑制细胞增殖的作用

目的探讨葛根素抑制膀胱尿路上皮癌T24细胞增殖的作用机制及潜在作用靶点。方法CCK8实验验证葛根素对T24细胞的增殖抑制作用。火山图和热图对芯片数据进行质量控制。对基因表达芯片实验得到的差异表达基因列表进行KEGG、GO通路富集分析、蛋白质相互作用(PPI)和上游转录因子预测,得到关键作用靶点及通路并进行相关验证。结果葛根素抑制T24细胞的增殖活力,这种抑制作用和浓度成正比,半数抑制浓度为218μmol·L^(-1)。KEGG通路富集分析显示差异基因主要富集在细胞生长和增殖相关通路,GO通路富集分析显示差异基因主要富集在蛋白质折叠、DNA复制和肿瘤细胞坏死相关通路。PPI分析得到关键作用靶点IL6。IL6在病理分期Ⅲ、Ⅳ期的表达明显高于Ⅱ期,并且PCR实验证明葛根素可降低T24细胞中IL6的表达。GSEA分析显示IL6与上皮细胞增殖相关。上游转录因子预测得到CENPA,分子对接结果显示葛根素和CENPA之间对接良好。结论葛根素能抑制T24细胞的增殖活力,其作用机制可能是葛根素和CENPA结合,降低IL6的表达进而影响蛋白质折叠、DNA复制、肿瘤细胞坏死和增殖相关通路,最终抑制T24细胞增殖。

姜黄素通过调控MicroRNA-1246激活P53蛋白对膀胱癌T24细胞进行放疗增敏的作用机制研究

目的探讨姜黄素对膀胱癌化疗增敏作用机制。方法对经过姜黄素和放射处理的T24细胞进行microRNA表达(miRNA芯片测序)、细胞活力(细胞增殖试验试剂盒)、集落形成、凋亡(AnnexinV-F)分析、ITC/7-AAD流式细胞计数(ITC/7-AAD)、miR-1246和p53mRNA(实时PCR)和蛋白质(Westernblot)表达的分析。结果芯片测序分析鉴定出17个差异表达的miRNA,在姜黄素处理的细胞中,与对照组相比,姜黄素显著降低T24细胞活力,并呈现浓度依赖性。miR-1246在T24细胞中的表达显著高于SV-HUC-1细胞,且高浓度的姜黄素(10或20μg·mL^(-1))可显著下调T24细胞miR-1246的表达。20μg·mL^(-1)浓度的姜黄素组和放疗处理联合应用对抑制miR-1246的表达、细胞活力和集落形成的作用优于姜黄素或者进行单独放疗处理组。通过与对照组相比,抑制miR-1246显著降低T24细胞的存活率。转染antagomiR-1246可显著提高T24细胞处于G0/G1期细胞比例,而转染antagomiR-NC细胞则诱导细胞凋亡。荧光素酶试验显示,miR-1246的过表达会抑制p53 3‘-UTR基因的荧光素酶活性。结论 miR-1246通过靶向抑制p53基因在膀胱癌细胞中的表达,参与到姜黄素和放疗的抗肿瘤治疗中。

雷帕霉素对膀胱癌T24细胞增殖及侵袭能力的影响

目的探讨雷帕霉素对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将T24细胞贴壁培养于10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中,37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞,随机分为处理组(加入浓度为10～1000nmol/L的雷帕霉素)和对照组(不加药物),每天更换RPMI1640培养液。采用MTT法检测各组细胞生长抑制率,transwell小室法检测细胞体外侵袭能力的变化。结果雷帕霉素对T24细胞有增殖抑制作用,呈剂量依赖关系。transwell法检测结果显示,雷帕霉素处理后的T24細胞体外侵袭能力明显下降,与雷帕霉素呈剂量依赖性。结论雷帕霉素具有抑制膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的作用。

小檗碱增强阿霉素诱导的膀胱癌T24细胞凋亡

目的:研究小檗碱对阿霉素诱导的膀胱癌T24细胞凋亡的影响及机制。方法:将膀胱癌T24细胞分为对照组、阿霉素组、阿霉素+小檗碱组和小檗碱组。采用CCK-8试剂盒测定膀胱癌T24细胞的增殖抑制率。采用Hoechst 33258染色剂检测细胞凋亡,同时测定caspase-3和caspase-9活性以及Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果:小檗碱呈剂量和时间依赖性地促进阿霉素诱导的T24细胞凋亡。与阿霉素组比较,小檗碱+阿霉素组caspase-3、caspase-9活性和Bax蛋白的表达水平明显增加,而Bcl-2蛋白表达水平降低。结论:小檗碱可进一步增强阿霉素对T24细胞增殖的抑制作用,其机制与小檗碱增强阿霉素诱导的T24细胞凋亡有关。

慢病毒介导NDRG2基因过表达抑制人膀胱癌T24细胞的侵袭和迁移

目的:观察N-Myc下游调节基因-2(N-Myc downstream-regulated gene 2,NDRG2)过表达对人膀胱癌T24细胞体外侵袭和迁移的影响。方法:采用携带NDRG2基因的慢病毒Lenti-NDRG2感染T24细胞,构建稳定过表达NDRG2的细胞株。Western blotting检测T24细胞中NDRG2、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9的表达,Transwell体外迁移和侵袭实验观察过表达NDRG2对T24细胞体外迁移和侵袭的影响。结果:建立了稳定过表达NDRG2的T24细胞株。与Lenti-Lacz组和空白对照组相比,Lenti-NDRG2组NDRG2蛋白的表达[(30.1±1.27)vs(9.9±1.24)、(8.2±1.28),P<0.01]明显提高;Lenti-NDRG2组MMP-2[(13.5±1.32)vs(30.7±1.29)、(28.8±1.30),均P<0.01]和MMP-9[(11.7±1.27)vs(25.2±1.28)、(26.4±1.31),均P<0.01]的表达明显降低;Lenti-NDRG2组T24细胞的侵袭细胞数[(18.1±3.4)vs(88.5±4.2)、(90.2±4.1)个,均P<0.01]和迁移细胞数[(20.1±3.5)vs(109.4±5.6)、(113.0±4.9)个,均P<0.01]明显减少。结论:慢病毒介导的NDRG2基因过表达可能通过降低MMP-2和MMP-9的表达而抑制人膀胱癌T24细胞的转移与侵袭。

姜黄素通过调控microRNA-7641及其靶基因p16抑制膀胱癌T24细胞增殖的机制研究

目的确定可能导致膀胱癌的mi RNAs,并研究其在姜黄素抗癌作用中的机制。方法对T24和SV-HUC-1细胞进行了芯片测序和q PCR分析。检测mi R-7641在含姜黄素或不含姜黄素的T24和SVHUC-1细胞株中的潜在致瘤性。并使用蛋白质印迹分析p16是mi R-7641在T24细胞中作用的重要靶基因。结果姜黄素诱导mi R-7641的表达下调及p16的上调,而p16是mi R-7641的转录后水平靶点之一,从而导致膀胱癌细胞凋亡增加。结论研究表明姜黄素可能是治疗无肌肉浸润性膀胱癌的临床治疗的潜在有效药物。

microRNA-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响及对VEGF和AP1蛋白的调节

【目的】研究microRNA-21(miR-21)对膀胱癌T24细胞系中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和活化因子蛋白-1(activatorprotein-1,AP1)及mRNA表达的调节作用,探讨miR-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响。【方法】用人工合成的miR-21相应的双链互补DNA片段,插入pSilencerTM3.1-H1neo载体表达载体,经测序鉴定后作为microRNA的表达质粒;用脂质体将miR-21高表达质粒转染进T24膀胱癌细胞,经G418筛选获得阳性克隆。用RT-PCR技术和Westernblot方法分别检测该细胞系中VEGF和AP1的mRNA和蛋白表达情况。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测膀胱癌T24细胞增殖的变化情况。【结果】Westernblot结果显示miR-21能够增加VEGF和AP1蛋白的表达,RT-PCR方法分析显示VEGF和AP1mRNA水平升高。MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显加快。【结论】miR-21促进T24膀胱癌细胞增殖,提示可能与VEGF和AP1的低表达有关。

吉西他滨诱导膀胱癌T24细胞自噬的实验研究

目的观察吉西他滨(gemcitabine,GEM)处理膀胱癌T24细胞后引起凋亡的同时是否诱导T24细胞自噬的产生,并初步探究其自噬产生的机制,以及自噬与凋亡之间的关系。方法体外培养T24细胞,应用CCK-8法测定细胞抑制率;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP的活化,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白P62和自噬潮,以及JNK通路相关蛋白Jnk1、P-Jnk、Bcl-2的表达情况;并通过透射电镜观察细胞超微结构自噬体的变化;Annexin V-PI双流式细胞术检测抑制自噬后细胞凋亡率的变化情况。结果 CCK-8检测结果显示吉西他滨能有效抑制膀胱癌T24细胞增殖;1.0μg/mL吉西他滨处理T24细胞4 h即可发生明显的自噬,透射电镜观察可见自噬体小体的形成;Western blot检测结果显示吉西他滨作用T24细胞后cleaved-Caspase-3、PARP和LC3-Ⅱ表达增高,P62表达降低;P-Jnk出现活化,Bcl-2发生降解;而抑制自噬后能显著增强吉西他滨诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡。结论吉西他滨介导膀胱癌T24细胞凋亡的同时又诱导保护性自噬,JNK信号通路参与调控其自噬的发生,抑制自噬可以明显增强膀胱癌T24细胞对吉西他滨的化疗敏感性。

姜黄素对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响

目的:旨在探讨姜黄素对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响。方法:细胞传代培养:培养人膀胱癌T24细胞,施加不同浓度姜黄素,观察对细胞的增殖、凋亡作用;应用四唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率(碘化丙啶染色)。结果:姜黄素各组较对照组增殖降低,存在剂量-效应关系。姜黄素各组较对照组凋亡升高,存在剂量-效应关系。结论:姜黄素抑制人膀胱癌T24细胞增殖,姜黄素促进人膀胱癌T24细胞凋亡。

曲古霉素A增强抗肿瘤药物对膀胱癌T24细胞的杀伤作用

目的观察HDAC抑制剂曲古霉素A(TSA)和针对DNA的抗癌药物联用对膀胱癌T24细胞的杀伤作用。方法用MTT法测定TSA单用及分别与ADM、MMC和DDP联用对T24细胞的抑制率,用金氏公式法判断联合用药的效果。结果TSA分别与ADM、MMC、DDP联合用药对T24细胞的抑制率均随着浓度的增加而明显增加,TSA与MMC联用的协同作用最明显,而TSA与ADM和DDP在中低剂量下联用亦表现为协同作用。结论HDAC抑制剂TSA可明显增强针对DNA的抗癌药物对膀胱癌细胞的杀伤作用,有希望应用于晚期膀胱癌的化疗方案中。

蜂毒素对人膀胱癌T24细胞体外增殖的抑制作用

目的探讨蜂毒素对人膀胱癌T24细胞体外增殖抑制作用及机制,为蜂毒素用于膀胱癌的临床应用提供依据。方法体外培养T24细胞,分别用0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0μg/mL蜂毒素处理,采用四甲基偶氮(MTT)法检测细胞增殖的抑制率;倒置显微镜观察细胞形态;TUNEL染色检测凋亡率和RT-PCR检测Bax和Bcl-2的mRNA的表达。结果蜂毒素处理后,T24细胞生长明显受到抑制,呈剂量依赖性;细胞出现典型的凋亡形态学改变;凋亡率随剂量升高以及Bax的表达升高而Bcl-2表达下降。结论蜂毒素在体外能抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,机制可能为诱导其细胞凋亡。

半乳糖凝集素3在膀胱癌组织中表达和临床意义及其对T24细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨半乳糖凝集素3(galectin-3)在膀胱癌组织中的表达与患者临床病理特征的关系及其对膀胱癌T24细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法:收集2014年5月至2016年6月在川北医学院附属医院收治的、经病理切片确诊的104例膀胱癌患者的癌和癌旁组织标本,用免疫组织化学法检测膀胱癌和癌旁组织中半乳糖凝集素3蛋白的表达,分析其表达与患者临床病理特征的相关性。将siRNA-Gal3、siRNA-Control分别转染至T24细胞,用Weatern blotting检测细胞的半乳糖凝集素3蛋白表达水平,MTT法检测细胞的增殖,Transwell实验检测细胞的侵袭,流式细胞术检测细胞的凋亡。结果:膀胱癌组织中半乳糖凝集素3阳性表达率显著高于癌旁组织(73.1%vs 9.6%,P<0.05),膀胱癌组织中半乳糖凝集素3的表达与组织学分级、肿瘤的浸润深度、淋巴结转移和TNM分期均有关(均P<0.05),与性别和年龄无关(P>0.05)。siRNA-Gal3显著下调半乳糖凝集素3蛋白的表达水平(P<0.05),干扰半乳糖凝集素3表达后:T24细胞的增殖能力和侵袭能力均明显降低(均P<0.05);细胞的凋亡率明显增加(P<0.05)。结论:半乳糖凝集素3在膀胱癌组织中呈高表达,并与膀胱癌患者临床病理特征存在密切关系。干扰半乳糖凝集素3蛋白的表达可抑制膀胱癌T24细胞的增殖与侵袭,促进细胞的凋亡。

VX-680诱导人膀胱癌T24细胞凋亡及其对Bcl-2表达的影响

目的:探讨Aurora A激酶抑制剂VX-680对人膀胱癌T24细胞凋亡的诱导作用及对Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响及意义。方法:体外培养T24细胞,分别给予不同浓度及作用时间的VX-680,Annexin V/PI检测细胞凋亡;Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学改变;RT-PCR和Western blot检测细胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表达。结果:Annexin V/PI显示,凋亡率分别随着浓度增高和时间增长而增加,呈浓度及时间依赖性;Hoechst染色发现细胞在处理72 h后,其凋亡增多程度及Bcl-2 mRNA和蛋白表达下调水平均随浓度增高而增加,呈浓度依赖性。结论:Aurora激酶抑制剂VX-680可能通过下调Bcl-2表达显著诱导人膀胱癌T24细胞凋亡,且具有浓度依赖性。

藏花素促膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的研究

目的研究藏花素诱导膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的作用及分子机制。方法通过MTT比色法分析藏花素对T24细胞增殖的影响;应用光镜观察细胞形态学的改变;Annexin V-FITC/PI荧光双标流式细胞术检测T24细胞周期动力学和凋亡诱导率的影响,RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达变化。结果藏花素能明显抑制T24细胞的增殖,并可导致其形态学的改变;随藏花素作用时间的延长,G0/G1期细胞比例逐渐增加,S期和G2/M期细胞比例逐渐减少,早期凋亡细胞逐渐增多,同时可以上调Bax和下调Bcl-2的基因表达水平。结论藏花素可明显抑制T24细胞的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,可能与Bcl-2和Bax等凋亡调控基因有关。

AMPKα过表达对膀胱癌T24细胞增殖、侵袭和EMT的抑制作用及其机制

目的:探讨AMP依赖的蛋白激酶α(AMP-activated protein kinaseα,AMPKα)过表达对膀胱癌T24细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的作用及其机制。方法:建立AMPKα过表达的膀胱癌T24细胞株,依据转染质粒的不同分为T24空白组、pc-DNA空载组和pc-AMPKα组。用Wb检测T24细胞AMPKα、EMT相关蛋白及EMT通路相关分子的表达水平,用Hoechst染色法检测转染后T24细胞的凋亡,CCK-8法检测T24细胞的增殖,细胞划痕愈合实验检测T24细胞的迁移,Transwell实验检测细胞的侵袭。结果:成功构建AMPKα过表达的膀胱癌T24细胞株。与T24空白组和pc-DNA空载组比较,pc-AMPKα组T24细胞上皮钙黏蛋白水平显著升高(P<0.01)、波形蛋白和神经钙黏蛋白表达水平显著降低(均P<0.01),EMT通路相关信号分子P38、STAT3活性受到显著抑制(均P<0.01),细胞发生明显凋亡、增殖能力显著减弱(均P<0.01);T24细胞迁移和侵袭能力显著降低(均P<0.01)。结论:AMPKα过表达可使EMT通路相关分子活性受到抑制,使得膀胱癌T24细胞发生明显凋亡、增殖受限并使其侵袭和迁移能力降低及伴随EMT的逆转。

猪苓多糖对膀胱癌T24细胞凋亡及细胞周期分布的影响

目的:探讨中药猪苓多糖(PPS)对膀胱癌 T24细胞的作用。方法:应用细胞计数形态学观察和流式细胞分析技术观察 PPS 对 T24细胞形态、细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果:PPS 组细胞数量减少,细胞形态改变,较多细胞伸出伪足。PPS 组凋亡细胞与对照组比较差异无显著性,但细胞周期分布中 S期细胞增加,G_2期细胞减少。结论:PPS 有抑制 T24细胞增殖作用,可能是通过阻止 T24细胞由 S 期进入G_2期所致。

猪苓多糖通过调节HuR介导bcl-2表达诱导T24细胞凋亡

目的研究猪苓多糖(polyporus polysaccharide,PPS)对膀胱癌T24细胞凋亡的作用及其机制。方法 T24细胞常规培养后加入不同剂量PPS,利用Hoechst染色、流式细胞术检测PPS对细胞凋亡的影响,利用q RT-PCR检测PPS对T24细胞bcl-2 m RNA表达水平及其稳定性的影响,通过Western Blot法检测PPS对T24细胞bcl-2蛋白、人抗原R(human antigen R,Hu R)蛋白的表达及对Hu R蛋白胞浆及胞核内分布的影响。结果与对照组比较,中、高剂量的PPS作用24 h后,T24细胞凋亡明显增多(P<0.05),bcl-2 m RNA稳定性降低(P<0.05),bcl-2蛋白及m RNA表达减少(P<0.05),总Hu R蛋白没有明显变化,但胞浆Hu R蛋白表达下降(P<0.05),胞核Hu R蛋白表达升高(P<0.05)。结论 PPS可诱导T24细胞凋亡,其作用可能与影响Hu R在细胞内定位,降低bcl-2 m RNA稳定性及减少bcl-2蛋白表达有关。

芹菜素对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡和CyclinD1、Caspase-3表达的影响

目的研究芹菜素(apigenin)诱导膀胱癌T24细胞凋亡的作用,探讨其作用机制。方法 CCK8法测定不同浓度芹菜素对T24细胞生长情况的影响;流式细胞术检测T24细胞周期情况;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术观察T24细胞凋亡情况;Western印迹法检测CyclinD1和Caspase-3蛋白表达的变化。结果芹菜素能诱导T24细胞凋亡(P<0.05),并明显抑制CyclinD1的表达(P<0.05,P<0.01),同时上调Caspase-3的表达(P<0.05,P<0.01)。结论芹菜素在体外可抑制T24细胞增殖,诱导其发生凋亡。其作用机制可能与CyclinD1的表达下降,Caspase-3的表达增加有关。