日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21(Toll like receptor 21)在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21(Aj TLR21)c DNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。Aj TLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,Aj TLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,Aj TLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,Aj TLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,在Aj TLR21 5′上游调控序列–1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,Aj TLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明Aj TLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡Aj TLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。

斑点叉尾TLR20和TLR21基因在不同细菌和病毒感染后的表达特征

应用实时荧光定量PCR技术,检测了TLR20和TLR21基因在斑点叉尾Ictalurus punctatus感染迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和斑点叉尾呼肠孤病毒(Channel Catfish Hemorrhage Reovirus,CCRV)后,在0、12、24、48、72h、7d,肝脏、头肾、脾脏、肠中的时空表达特征。结果显示,4种病原均能引起斑点叉尾TLR20、TLR21基因在所测免疫相关组织中表达量的变化,但呈现出不同的表达模式:感染嗜水气单胞菌后这两种基因的表达差异巨大,而TLR21基因的表达变化不大,在肝脏和头肾中表达量仅在3倍以内变化。感染爱德华氏菌后,TLR20、TLR21两种基因的表达模式类似,在肝脏中表达量显著上调。链球菌引起肝脏TLR20表达量发生4 360倍的变化,远远高于TLR21基因在同组织中的表达量(257.8倍)。斑点叉尾呼肠孤病毒感染引起TLR20、TLR21两种基因在肝脏、头肾的上调表达,肠、脾脏的下调表达。以上结果表明了TLR20、TLR21在斑点叉尾天然免疫应答中起重要作用,为研究鱼类疾病防御机制提供了理论参考。

TLR21在斑马鱼免疫功能中的作用研究

[目的]研究斑马鱼TLR21受体家族的作用。[方法]用各种纯组分刺激斑马鱼,研究斑马鱼TLR21受体家族(zTLR21.1、zTLR21.3、zTLR21.4)的表达量变化,推测它们的功能。[结果]zTLR21.1对于LTA刺激无反应,对于LPS、ployI:C和Glucan刺激都有上调反应。zTLR21.3和zTLR21.4对于LPS、LTA和ployI:C刺激均无反应,对于Glucan刺激有明显上调变化。[结论]zTLR21.1可能是一种能够识别大部分抗原的模式识别受体。zTLR21.3和zTLR21.4的功能很类似,可能都是酵母的特异识别受体。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR21基因在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达特征

应用荧光定量PCR技术,检测了TLR21基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)后,在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、6 d后,在心脏、肝脏、脾脏、头肾、鳃、小肠、肌肉和血的时空表达特征,并探讨了它们与牙鲆先天免疫反应的关系。结果表明,大多组织在感染病原6 h后TLR21基因表达明显上调,尤其是头肾和小肠。头肾6 h的表达量达到了对照组的59.3倍,小肠6 h的表达量为对照组的38.6倍。迟缓爱德华氏菌感染引起牙鲆体内各组织中TLR21的上调表达和变化,为研究牙鲆对迟缓爱德华氏菌的防御机制提供了理论依据。

线纹海马Hippocampus erectus的tlr21基因结构及其对CpG-ODN的应答特征

作为先天性免疫反应中重要的模式识别受体之一,TLR(toll-likereceptor)基因家族介导的先天性免疫是脊椎动物抵御病原微生物的重要防线。研究分析了线纹海马Hippocampus erectus tlr21基因的序列特征,并基于抗原注射实验探讨了海马tlr21的免疫功能。线纹海马tlr21基因的开放阅读框长度为2946bp,编码981个氨基酸,预测其编码蛋白相对分子量为246.98kDa,理论等电点为4.78。tlr21编码蛋白主要包含1个信号肽和3个功能结构域:胞外区具有14个富含亮氨酸重复序列的结构域(LRR),跨膜区具有富含半胱氨酸的结构域,胞内区则具有TIR结构域。同源性比较和系统进化分析表明,线纹海马tlr21基因与虎尾海马Hippocampuscomestlr21基因的同源性最高,其次与斜带石斑鱼Epinephelus coioides、牙鲆Paralichthys olivaceus、大菱鲆Scophthalmus maximus和红鳍东方鲀Takifugu rubripes的tlr21基因聚为一枝。tlr21基因在线纹海马的脑、鳃、肝、肠、肾、性腺、肌肉和育儿袋各组织均有分布,肾脏中表达量最高。抗原注射实验结果发现,线纹海马Tlr21对不同类型CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)的识别能力存在差异,其中,CpG-2007和CpG-HC4040对海马肾脏tlr21的mRNA表达量具有显著的促进作用(P<0.05)。研究表明,线纹海马Tlr21能够通过识别含CpG序列的DNA发挥免疫识别作用,研究结果将有助于系统认识海马免疫系统中TLR家族基因的功能特征,为建立海马病害防治策略提供理论依据。

饲料中维生素D3的添加水平对黄颡鱼幼鱼生长和Toll样受体TLR18、TLR19和TLR21的影响

为了探讨饲料中维生素D3添加水平对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)生长和Toll样受体的影响,研究设计了5个不同浓度梯度的维生素D3饲料(1120、2260、3950、8030和16600 IU/kg),对体重为(5.0±0.2) g的黄颡鱼进行了为期12周的生长实验,并在生长实验结束后进行鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)攻毒72h。于攻毒前(0)和攻毒后(72h)采样,每个饲料组分别取6尾鱼的脾脏、头肾、肝脏和前肠四个组织,检测不同浓度维生素D3处理对攻毒前和攻毒后TLR18、TLR19和TLR21基因表达量的影响。同时另取6条新鲜黄颡鱼的肌肉、头肾、肾脏、皮肤、脑、鳃、脾脏、胃上皮、小肠和肝脏,检测TLR18、TLR19和TLR21基因在黄颡鱼中的组织分布。结果表明:不同的维生素D3添加水平会显著影响黄颡鱼幼鱼的生长性能;TLR18、TLR19和TLR21基因在所检测的组织中均有表达,但在脾脏中表达量最高;饲料中不同维生素D3含量在攻毒前后均会显著影响TLR18、TLR19和TLR21在头肾、脾脏、肝脏和前肠中的表达,攻毒后基因的表达显著高于攻毒前;TLR18、TLR19和TLR21在不同组织中的表达和饲料中维生素D3的浓度相关,研究结果表明饲料中添加合适剂量的维生素D3,可以促进相关免疫基因的表达,从而增强黄颡鱼对病原微生物的抵抗力。

三黄鸡TLR21基因启动子区的克隆与序列分析

为了对三黄鸡TLR21基因启动子区序列进行遗传特征分析,试验采用酚-氯仿抽提法提取鸡肉组织DNA,设计引物扩增TLR21基因启动子区部分序列,进行单核苷酸多态性检测,并与京白939、来亨鸡、海兰褐壳蛋鸡、农大褐3号、白羽乌骨鸡等5个品种鸡进行对比。结果表明:三黄鸡的TLR21基因启动子区序列与其他5个品种鸡的对应序列同源性达到99%以上,在第46,94,130,150,200,220,1 216位出现单核苷酸多态性;三黄鸡与来亨鸡亲缘关系最近,与农大褐3号亲缘关系最远。

雷公藤甲素通过lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴抑制细胞焦亡改善佐剂型关节炎大鼠炎症

目的探讨雷公藤甲素(TP)通过lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴抑制细胞焦亡改善AA大鼠炎症的机制。方法将大鼠分为4组,每组6只:正常组(NC),模型组(MC),雷公藤甲素组(TP)和甲氨蝶呤组(MTX)。建立AA大鼠模型,观察大鼠一般状态、右足跖肿胀度和关节炎指数;HE染色检测各组大鼠关节滑膜组织病理形态;ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子水平;荧光定量PCR检测Caspase-1、IL-1β、NLRP3、GSDMD、GAS5、TLR4、NF-κB、miR-21 mRNA表达水平;Western blot检测Caspase-1、NLRP3、GSDMD、NF-κB、Caspase-4、TLR4蛋白的表达情况。结果与NC组比较,MC组大鼠肿胀度、关节炎指数显著升高(P<0.05),炎性细胞浸润增加;与MC组比较,TP组和MTX组IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子水平下降(P<0.05),Caspase-1、IL-1β、NLRP3、GSDMD、TLR4、NF-κB、miR-21 mRNA表达水平减少,GAS5 mRNA表达增加(P<0.05),Caspase-1、NLRP3、GSDMD、NF-κB、Caspase-4、TLR4蛋白水平下降(P<0.05);与MTX组比较,TP组IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子水平下降(P<0.05),Caspase-1、IL-1β、NLRP3、GSDMD、TLR4、NF-κB、miR-21 mRNA表达水平减少(P<0.05)。结论雷公藤甲素可能通过lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴,抑制细胞焦亡,抑制促炎因子产生,改善AA大鼠炎症。