CpG-c41对TLR9信号通路的干扰作用及其机制探究

目的探讨Cp G-c41分子对TLR9信号通路的干扰作用及其机制。方法获取小鼠骨髓巨噬细胞,M-CSF刺激使骨髓细胞向单核巨噬细胞分化,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测诱导成功的巨噬细胞的比例;培养Raw264.7细胞,ELISA法检测Cp G-c41分子对TLR9激动剂Cp G-1826刺激小鼠来源骨髓巨噬细胞和Raw264.7细胞诱发的炎症因子TNF-α和IL-6的影响;Western blot检测Cp G-c41对TLR9-My D88依赖型信号通路中磷酸化NF-κB蛋白表达的影响;ELISA法检测非Cp G-ODN分子对Cp G-1826刺激Raw264.7细胞诱发的炎症因子TNF-α和IL-6的影响;免疫荧光检测Cp G-c41与TLR9的共定位情况以及Cp G-c41对Cp G-1826与TLR9结合的影响。结果 Cp G-c41抑制Cp G-1826诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的释放(P<0.01);Cp G-c41抑制TLR9信号通路中NF-κB的磷酸化表达;非Cp G-ODN不影响Cp G-1826诱导TLR9释放TNF-α和IL-6;Cp G-c41通过与TLR9竞争性结合抑制Cp G-1826与TLR9识别。结论 Cp G-c41通过竞争性结合TLR9干扰TLR9-My D88信号通路的活化。

鸦胆子苦醇通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的机制研究

目的探究鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的分子机制。方法针对本实验室保存的Hela细胞,使用不同浓度(0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 nmol·L^(-1))的鸦胆子苦醇处理细胞。并将Hela细胞分为Control组(正常培养的Hela细胞)、BRU-L组(使用10.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)BRU-H组(使用20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)、BRU+pcDNA-NC组(转染pcDNANC+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)、BRU-H+pcDNA-TLR9组(转染pcDNA-TLR9+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和EdU法检测各组细胞增殖情况;TUNNEL染色法,经流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞TLR9、MyD88、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)情况、ELISA检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)和活性氧基团(ROS)含量。结果与0 nmol·L^(-1)组比较,10 nmol·L^(-1)组细胞活存活率、IC50值开始显著降低(P<0.05)。不同浓度的BRU刺激细胞后,细胞增殖能力显著降低,且呈剂量依赖(P<0.05)。。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)阳性细胞率、缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著降低,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显增加(P<0.05);Control组、BRU-L、BRU-H组/BRU-H+pcDNA-NC呈持续递减/递减趋势(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组EDU阳性细胞率、TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著升高,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显降低(P<0.05)。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞JC-1水平和ATP含量显著降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平显著增加(P<0.05);与BRU-L组比较,BRU-H组、BRU-H+pcDNANC组JC-1水平和ATP含量进一步降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平进一步增加(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组细胞JC-1水平和ATP含量增加,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平降低(P<0.05)。结论鸦胆子苦醇可通过调控TLR9-MyD88信号通路制Hela细胞增殖。

枸杞多糖通过调控TLR9/AP-1信号通路对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子及鼻黏膜中嗜酸性粒细胞炎症的影响

目的探究枸杞多糖通过调控Toll样受体9/激活蛋白-1(TLR9/AP-1)信号通路对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞炎症的影响。方法选取60只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(A)组,模型(B)组,糠酸莫米松(C)组,枸杞多糖(D)组,TLR9/AP-1信号通路抑制剂(E)组,TLR9/AP-1信号通路抑制剂联合枸杞多糖(F)组,每组各10只,对B、C、D、E、F组采用卵清蛋白致敏法建立变应性鼻炎模型,A组不建立该模型。建模成功后,对C组给予1喷/侧的糠酸莫米松喷鼻治疗,对D组灌胃100 mg/kg的枸杞多糖,对E组灌胃20 mg/kg AP-1抑制剂SP100030,对F组给予SP100030联合枸杞多糖,A、B组同期给予灌胃同体积生理盐水,对大鼠鼻部症状进行评分,HE染色法检测鼻黏膜组织病理形态及嗜酸性粒细胞并计数,ELISA法检测大鼠血清中Th1/Th2细胞因子水平,免疫印迹法检测鼻黏膜组织中TLR9/AP-1信号通路相关蛋白表达。结果与A组相比,B组鼻部症状评分、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞数目、血清IL-4含量显著升高(P<0.05),血清中INF-γ含量显著降低(P<0.05);与B组比较,C、D两组鼻部症状评分、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞数目、血清IL-4含量显著降低(P<0.05),血清中INF-γ含量显著升高(P<0.05),且D组比C组变化显著(P<0.05);A组大鼠鼻黏膜组织结构完整,B组鼻黏膜上皮结构紊乱且不完整,出血及嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润;与B组相比,C、D组病理状态明显改善,嗜酸性粒细胞明显减少;与A组比较,B组鼻黏膜组织中TLR9、AP-1蛋白表达显著升高(P<0.05),与B组比较,C、D组鼻黏膜组织中TLR9、AP-1蛋白表达显著降低(P<0.05),且D组比C组变化显著(P<0.05),而E组与D组相比无明显差异(P>0.05),F组比E组降低明显(P<0.05)。结论枸杞多糖可有效调控变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子水平、减轻鼻黏膜中嗜酸性粒细胞炎症,其机制可能与抑制TLR9/AP-1信号通路有关。

妇炎舒胶囊对SPID模型大鼠TLR9/MyD88信号通路的影响

目的观察妇炎舒胶囊对盆腔炎性疾病后遗症(sequelae of PID,SPID)模型大鼠抗炎疗效及对TLR9/MyD88信号通路的影响。方法36只大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、康妇炎胶囊组(KFY组)、妇炎舒胶囊高剂量组(FYS高剂量组)、妇炎舒胶囊中剂量组(FYS中剂量组)、妇炎舒胶囊低剂量组(FYS低剂量组)。采用混合菌液注射配合机械损伤法建立SPID动物模型,操作结束后常规饲养14 d。空白组以蒸馏水灌胃,其余各组以相应药物混悬液灌胃21 d。病理切片HE染色观察子宫组织形态变化,ELISA法检测子宫组织IL-6、IL-1β的表达水平,Western Blot检测子宫组织TLR9、MyD88蛋白的表达,RT-PCR检测子宫组织TLR9、MyD88 mRNA的表达。结果与模型组比较,FYS高剂量组IL-6、IL-1β显著降低(P<0.01或P<0.05),FYS低、中剂量组有降低趋势(P>0.05)。FYS高剂量组TLR9、MyD88蛋白表达显著降低(P<0.01),FYS高剂量组MyD88 mRNA显著降低(P<0.05),FYS低、中剂量组TLR9 mRNA、MyD88 mRNA有降低趋势(P>0.05)。结论妇炎舒可能通过调控TLR9/MyD88信号通路关键因子TLR9、MyD88、IL-6、IL-1β表达发挥抗炎作用。

藏茵陈对重症胰腺炎大鼠TLR9/MyD88/NF-κBp65信号通路的影响

目的:探讨藏茵陈对重症胰腺炎大鼠TLR9/MyD88/NF-κBp65信号通路的影响。方法:将大鼠分为假手术组、模型组及藏茵陈高、中、低剂量组,连续灌胃给药14天后造模。采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)及Toll样受体(toll-like receptors 9,TLR9)、髓样分化因子(Myeloid differentiation primary response gene,MyD88)、核转录因子kappa B p65(nuclear factor kappa Bp65,NF-κBp65)的蛋白表达;实时荧光定量PCR测定IL-1、IL-6、TNF-α及TLR9、MyD88、NF-κBp65的基因表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠IL-1、IL-6、TNF-α及TLR9、MyD88、NF-κBp65的蛋白和基因表达均升高(P<0.05);与模型组比较,藏茵陈高剂量组能够降低大鼠胰腺组织IL-1、IL-6、TNF-α及TLR9、MyD88、NF-κBp65的蛋白和基因表达(P<0.05)。结论:藏茵陈能阻断TLR9/MyD88/NF-κBp65信号通路,减轻重症胰腺炎大鼠炎症反应。

基于TLR9/MyD88信号通路探讨针刺干预运动损伤炎症反应的研究进展

Toll样受体9(TLR9)能够通过髓样分化蛋白88(MyD88),激活核因子κB(NF-κB)及干扰素调节因子7(IRF7)诱导宿主固有免疫应答,调节促炎因子释放。线粒体DNA(mtDNA)一直是激活TLR9/MyD88信号通路的关键靶点。近年来研究发现机体很多细胞损伤的炎症反应都可以检测到TLR9及其下游相关蛋白的表达,并都以mtDNA作为配体。而运动损伤极易导致线粒体损伤,触发mtDNA泄露,从而可能激活TLR9/MyD88信号通路。研究表明运动损伤后促炎因子持续表达是导致骨骼肌延迟性肌肉酸痛(DOMS),肌组织纤维化变性重要因素。针刺可以通过神经体液双重调节机制来干预运动损伤病理过程。但目前针刺是否可以通过TLR9/MyD88信号通路来干预运动性损伤炎症反应的研究较少,本文是在综合其他炎症相关疾病研究基础上进行拓展延伸,以期为针刺干预和纠正运动损伤炎症反应寻找新的靶向调控点。

干扰素-γ水平影响系统性红斑狼疮小鼠体TLR9/MyD88/NF-κB p65信号通路的初步研究

目的探究干扰素-γ(IFN-γ)水平对系统性红斑狼疮(SLE)小鼠体内Toll样受体9/髓样分化因子88/核因子κB亚基p65(TLR9/MyD88/NF-κB p65)信号通路的影响。方法将30只SLE MRL/lpr小鼠随机分为模型组、空质粒组和IFN-γsiRNA组,空质粒组和IFN-γsiRNA组采用活体电转染技术分别转入空质粒、IFN-γsiRNA质粒,并鉴定转染后SLE小鼠外周血IFN-γ的表达;另取10只C57BL/6小鼠作为正常组,ELISA检测IL-6、TNF-α和自身抗体[抗双链DNA(ds-DNA)抗体、抗组蛋白抗体(IgM)]水平,观察各组小鼠肾组织病理变化及肾功能情况[血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)],Western blot检测肾组织中TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白表达。结果与正常组比较,模型组血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、抗ds-DNA抗体、抗IgM抗体、SCr、BUN、肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65磷酸化水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,IFN-γsiRNA组IFN-γ、IL-6、TNF-α、抗ds-DNA抗体、抗IgM抗体、SCr、BUN、肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65磷酸化水平显著降低(P<0.05);但空质粒组与模型组上述指标的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染IFN-γsiRNA质粒后,可减轻SLE小鼠炎症反应与肾损伤,可能与抑制TLR9/MyD88/NF-κB p65信号通路有关。

齐墩果酸对牙髓炎大鼠TLR9/MyD88/NF-κB p65信号通路的影响

目的探讨齐墩果酸(OA)对牙髓炎大鼠TLR9/MyD88/NF-κB p65信号通路的影响。方法建立牙髓炎大鼠模型,随机分为模型组、OA低剂量(40 mg/kg)组、OA中剂量(80 mg/kg)组、OA高剂量(160 mg/kg)组、甲硝唑(MTZ)(40 mg/kg)组,每组12只,另取12只大鼠设为对照组。分组给药后,检测大鼠根髓坏死比率;以HE染色检测大鼠牙髓组织病理情况;以试剂盒检测大鼠牙髓组织氧化应激因子SOD、MDA及血清促炎因子IFN-γ、IL-6水平;以免疫印迹实验检测大鼠牙髓组织TLR9/MyD88/NF-κB p65通路相关蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组大鼠牙髓组织发生严重病理损伤,根髓坏死比率、MDA、IFN-γ及IL-6水平、TLR9、MyD88、核内NF-κB p65蛋白表达显著升高(P<0.05),SOD水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,OA低、中、高剂量组及MTZ组大鼠牙髓组织病理损伤减轻,根髓坏死比率、MDA、IFN-γ及IL-6水平、TLR9、MyD88、核内NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05),SOD水平升高(P<0.05),且OA各组呈剂量依赖性(P<0.05),OA高剂量组与MTZ组比较,无显著差异(P>0.05)。结论OA可下调TLR9/MyD88/NF-κB p65通路蛋白,抑制牙髓炎大鼠氧化应激及炎症反应,减轻牙髓组织损伤,改善大鼠临床症状。

健脾理气方对功能性消化不良模型大鼠十二指肠TLR9/NF-κB/iNOS通路的影响

目的观察健脾理气方对功能性消化不良模型大鼠十二指肠toll样受体9(TLR9)、核转录因子(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的影响。方法 36只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组及中药治疗组各12只,以夹尾应激法建立功能性消化不良(FD)动物模型,给予正常组及模型组生理盐水灌胃,中药治疗组健脾理气方水煎剂灌胃。取大鼠十二指肠组织进行HE染色观察组织形态,同时应用定量PCR(q PCR)和Western blot检测TLR9、NF-κB mRNA及iNOS蛋白表达情况。结果 HE染色显示3组大鼠十二指肠形态学未见异常,模型组大鼠十二指肠NF-κB及TLR9 mRNA及iNOS蛋白表达明显高于正常组(P<0.05),中药治疗组十二指肠以上指标的水平较模型组明显降低(P<0.01)。结论健脾理气方通过抑制TLR9/NF-κB/iNOS信号通路进而改善十二指肠的微炎症表达,可能是健脾理气方治疗FD的机制之一。

基于TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路研究马钱子水提物改善类风湿关节炎大鼠疼痛的作用机制

基于Toll样受体4(Toll⁃like receptors 4,TLR4)/肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)/基质金属蛋白酶⁃9(matrix metalloproteinase⁃9,MMP⁃9)信号通路探索马钱子水提物(aqueous extract of Strychni Semen,SA)改善类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠疼痛的作用机制。首先通过TCMSP、TCMID、ETCM等数据库以及相关文献查找马钱子的主要化学成分;借助TargetNet和SwissTargetPrediction等数据库查找马钱子化学成分的主要作用靶点;通过GeneCards、OMIM和TTD等数据库获取RA和疼痛的主要靶点;Venny 2.1.0平台获取三者的交集靶点;利用STRING平台和Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白互作网络。随后利用AutoDock Vina软件进行分子对接验证。最后建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎(typeⅡcollagen⁃induced arthritis,CIA)大鼠模型,up⁃down法和丙酮法检测大鼠机械痛敏及冷痛敏反应,评价SA对CIA大鼠的镇痛作用;通过苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin,HE)染色评价CIA大鼠关节组织病理学变化。采用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测关键靶点蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应法(real⁃time PCR)检测关键靶点mRNA的表达水平。网络预测结果表明,马钱子可能通过作用于TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路发挥镇痛作用。进一步分子对接结果显示,SA主要活性成分马钱子碱与TLR4、TNF⁃α、MMP⁃9蛋白受体均有较强结合能力。实验验证结果显示,SA对CIA大鼠的机械刺激痛敏及丙酮刺激冷痛敏反应均具有较好的改善作用(P<0.05,P<0.01),且可显著降低CIA大鼠关节组织病理学评分(P<0.01);此外,SA中、高剂量可显著降低TNF⁃α、TLR4、MMP⁃9蛋白和mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。综上,SA对CIA大鼠机械刺激痛敏、丙酮刺激冷痛敏反应及关节组织病理改变均具有较好的改善作用,其作用机制可能与抑制TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路过度活化有关。

当归-白芍联合BM-MSCs移植对NASH相关肝硬化小鼠肝脏炎症及肝细胞再生的影响

目的观察当归-白芍药对联合骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关肝硬化小鼠肝脏炎症及肝细胞再生的影响,探讨其可能机制。方法采用西式饮食联合四氯化碳复合诱导法制备NASH相关肝硬化小鼠模型,将小鼠随机分为对照组、模型组、当归-白芍组、BM-MSCs组和当归-白芍+BM-MSCs组,每组12只。造模成功后,按分组予相应干预,连续4周。HE染色观察肝组织形态;检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、三酰甘油(TG)、白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)含量及肝组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、肝细胞生长因子(HGF)含量;RT-qPCR检测肝细胞Toll样受体9(TLR9)、髓样分化因子88(MyD88)、TNF受体相关因子6(TRAF6)、核因子-κB(NF-κB)p65 mRNA表达;分离肝脏原代细胞,行体外CpG ODN 2216诱导刺激,提取细胞上清液,检测IL-1β和TNF-α含量。结果与对照组比较,模型组小鼠肝组织炎性细胞浸润,伴肝细胞坏死和胶原沉积,形成假小叶;血清ALT、AST、TBil、TG含量升高,ALB含量下降,肝组织HGF含量下降,IL-1β、TNF-α含量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);肝细胞TLR9、MyD88、TRAF6、NF-κBp65 mRNA表达升高(P<0.05),CpG ODN 2216诱导后肝细胞上清液IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05)。与模型组比较,当归-白芍+BM-MSCs组小鼠肝组织炎性细胞浸润及肝细胞坏死减少,肝纤维化程度减轻,当归-白芍组和BM-MSCs组小鼠肝组织损伤轻度好转;除BM-MSCs组血清TG含量外,各干预组检测指标均明显改善(P<0.05)。与当归-白芍组及BM-MSCs组比较,当归-白芍+BM-MSCs组相关检测指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论当归-白芍联合BM-MSCs移植可有效改善NASH相关肝硬化小鼠肝功能,促进肝细胞再生,其机制与下调TLR9/NF-κB信号通路表达及功能,抑制炎症因子分泌,改善肝脏炎症微环境有关。