TOX介导T细胞耗竭的机制及其逆转研究

胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白(TOX)是一种与DNA结合的转录因子,参与免疫细胞的发育过程。TOX是促进T细胞耗竭的关键转录因子,并与肿瘤的发生发展密切相关,提示TOX可能是潜在的免疫生物标志物和恶性肿瘤免疫治疗的靶点。本文就TOX介导T细胞耗竭的分子机制及其逆转研究的最新进展做一综述,为设计基于TOX更为精准的肿瘤免疫治疗策略提供依据。

电阻点焊与TOX连接技术的对比试验

目前在国内板件常用的连接方法中应用最多的是点焊和铆接,而TOX连接工艺由于其环保、节能、设备投资小的特点,得到越来越广泛的应用。在此介绍了TOX连接工艺的原理、特点及应用范围,通过对汽车常用铝板和冷轧板的连接试验,确定了几种板材TOX连接工艺在达到最大强度时的工艺参数范围,同时通过相同板材的点焊试验结果对比,得出了TOX连接工艺单点及双点连接强度与点焊强度的关系,找出TOX连接工艺与传统点焊连接工艺的共同点及区别以及TOX连接工艺在设备、板材连接、检测方法上的优势。

稳定过表达TOX3的乳腺癌MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建人TOX高迁移率蛋白家族成员3(TOX3)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达TOX3的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系。方法通过全基因合成法合成TOX3基因序列片段,并进行PCR扩增。将TOX3基因克隆到pLVEF-1a/GFP-Puro载体中,构建pLVEF-1a/GFP-Puro-TOX3慢病毒载体。经酶切和测序鉴定后,将构建好的慢病毒载体进行病毒包装和病毒滴度检测。用获得的慢病毒液转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,通过嘌呤霉素选择性培养,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞中TOX3 mRNA的表达,Western blot法检测MDA-MB-231细胞中TOX3蛋白的表达。结果经酶切和测序鉴定,成功构建了pLVEF-1a/GFP-Puro和pLVEF-1a/GFP-Puro-TOX3慢病毒表达载体,病毒包装后检测病毒滴度分别为2×108TU/mL和1×108TU/mL,转染MDA-MB-231细胞后,GFP表达的细胞达95%以上。与阴性对照组相比,qRT-PCR和Western blot结果显示,MDA-MB-231-TOX3细胞中TOX3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。结论成功构建了TOX3慢病毒表达载体并建立了稳定过表达TOX3的MDA-MB-231细胞系。

无机物的ADME/Tox研究

无机物的吸收、分配、代谢和排除以及毒性 ( ADME/Tox)研究在药物和毒物研究中非常重要。近年来发展的在细胞层次上应用高通量和计算机等技术系统探索药物先导化合物的 ADME/Tox发展迅速。金属和其它无机化合物的 ADME/Tox研究在国内外都还是一个新兴的、具有广阔发展前途的跨学科研究领域。本文综述了国内外对于铁和铜以及稀土等金属的化合物的 ADME/Tox研究结果 。

TOX3基因rs3803662位点基因型与乳腺癌病理、临床特征的关系

目的 探讨TOX3基因rs3803662位点基因型与病理、临床特征的关系.方法 采用TaqMan 单核苷酸多态性（SNP）法检测TOX3基因rs3803662位点基因型,分析不同病理特征和临床特征与基因型分布的关系.结果 病理类型、组织分级、淋巴结转移、ER状态等病理特征与rs3803662位点基因型分布无关（P＞0.05）;IDC型和SBR3级变异型基因携带率分别显著高于DCIS型和SBR2级（P＜0.05）.诊断时年龄、临床分期、月经持续时间（年）及月经状态等临床特征与rs3803662基因型分布有关（P＜0.05）,纯合突变携带率随月经持续年限增加而显著增加（PTrend=0.034）.结论 TOX3基因rs3803662位点变异型基因与病理类型和组织分级有关,与临床分期、月经持续时间等临床特征有关.

肠出血性大肠杆菌O157∶H7toxB基因的分片段克隆和表达

根据Gen Bank已有tox B基因全长序列,分别设计6对引物扩增tox B基因,克隆到质粒p GEX-4T-1,构建重组菌BL21(plys)(p GEX-4T-1-tox B),IPTG诱导表达重组蛋白质,用Western blot鉴定重组蛋白质免疫原性。tox B基因片段大小分别为1 531 bp、1 590 bp、1 609 bp、1 603 bp、1 525 bp和1 690 bp,重组蛋白质分子量分别为8.1×104、8.3×104、8.4×104、8.3×104、8.0×104和8.7×104。以兔源EHEC O157∶H7抗血清为一抗,Western blot分析结果显示6个重组蛋白质均具有良好的免疫原性。

CMV, HSV 和 TOX 感染与先天性心脏病的关系

目的：为了探讨巨细胞病毒（ Ｃ Ｍ Ｖ）、弓形体（ Ｔ Ｏ Ｘ）和单纯疱疹病毒（ Ｈ Ｓ Ｖ）感染与先天性心脏病病因学的关系．方法：收集先天性心脏病心肌组织６６ 份，非先心病心肌组织３８ 份，采用 Ｐ Ｃ Ｒ技术进行病原基因的检测． 结果：在６６ 例先心病心肌组织中检测到 Ｃ Ｍ Ｖ， Ｈ Ｓ Ｖ， Ｔ Ｏ Ｘ 的阳性率分别为２６％ ，４％ 和１５％ ，而３８ 例对照组中阳性率分别为２１％ ，３％ 和３％ ， Ｔ Ｏ Ｘ 在两组中检测有显著性差异（ Ｐ＜ ０．０５），而 Ｃ Ｍ Ｖ， Ｈ Ｓ Ｖ 在两组中无统计学意义（ Ｐ＞ ０．０５）． 结论：我们首次应用 Ｐ Ｃ Ｒ技术在先心病的心脏组织中检测到了巨细胞病毒、弓形体和单纯疱疹病毒基因，提示 Ｔ Ｏ Ｘ 的感染与先心病的发病关系密切，而 Ｃ Ｍ Ｖ， Ｈ Ｓ Ｖ 的感染与先心病间无关．

细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌Tox基因影响

目的探讨细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌毒力基因及其表达的影响。方法以非高渗分离培养法诱导并获得产毒性白喉棒状杆菌稳定L型纯培养物,提取白喉棒状杆菌稳定L型的染色体DNA,用Tox基因特异性引物进行PCR扩增,并进行序列测定和分析。分别采用对流免疫电泳(CIEP)和十二烷基磺酸钠-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测白喉棒状杆菌稳定L型可溶性代谢产物中的白喉毒素蛋白质。结果白喉棒状杆菌在氨苄青霉素作用下可发生细胞壁缺陷而成为L型,该稳定L型的传代培养物可仍然保留同其亲代细菌型一致的Tox基因及其核苷酸序列;但在其可溶性代谢产物中并未检测到白喉毒素蛋白质。结论白喉棒状杆菌稳定L型虽然保留了Tox基因但并不能表达白喉毒素蛋白质,提示细胞壁缺陷可影响Tox基因在宿主菌细胞内的表达。

TOX3基因单核苷酸多态与乳腺癌风险的相关性Meta分析

目的对多个乳腺癌病例对照研究的样本进行Meta分析,探讨TOX3基因单核苷酸多态与乳腺癌风险的关系。方法全面检索相关文献,收集2005年1月至2011年3月发表的关于TOX3基因rs3803662位点多态性与乳腺癌易感性的病例对照研究,采用Stata11.0统计软件包进行Meta分析。结果最终纳入病例对照研究7项,累计病例24 464例,对照32 353例。除了杂合子模型(OR=1.12,95%CI:0.99-1.27),纯合子(OR=1.34,95%CI:1.43～1.59)、显性遗传(OR=1.16,95%CI:1.03～1.31)、隐性遗传(OR=1.25,95%CI:1.10～1.42)模型中结果均有统计学意义。结论 TOX3基因rs3803662位点的多态性可能是乳腺癌的危险因素。②高加索人群的TOX3基因rs3803662位点突变的纯合子模型和隐形遗传模型可能会增加人群患乳腺癌的危险性,纯合子基因型TT是乳腺癌的危险因素。

TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均>2×10^8 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。

白喉毒素及其编码基因TOX在分子生物学中的应用

对白喉毒素及其编码基因的结构及其作用原理进行了详细说明 。

钢/铝异种金属TOX圆点铆接工艺研究

TOX圆点铆接是钢/铝异种金属连接的有效手段。以5A05(O)铝板和冷轧钢板(SPCC)的TOX铆接为研究对象,研究压强、材料组合方式对钢/铝异种金属TOX圆点铆接接头的影响,以及不同表面处理工艺下钢/铝异种金属接头经过盐雾试验后的性能变化。结果表明,TOX圆点铆接接头底厚随着压强增大而降低,当压强增加到27MPa时,底厚变化趋于平缓,接头抗剪强度达到最大值;钢板在凸模侧所得到的接头抗剪强度高于铝板在凸模侧所得到的接头;板材涂覆后进行铆接的接头防腐性能最优,但抗剪强度降低明显。

促细胞增殖新基因TOX的功能研究

利用GenBank中的数据,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从人的cDNA文库中克隆得到功能基因TOX(thymocyte selection-associated high mobility group box),运用生物信息学分析其结构特性,并通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)分析TOX在细胞系中的表达;利用荧光显微镜观察其亚细胞定位情况;使用细胞生长曲线实验和流式细胞术分析TOX对细胞增殖及细胞周期的影响.结果表明:TOX基因定位于人8号染色体q12.1上,全长4 131bp,编码526个氨基酸,该蛋白质分子质量约为57ku,含有9个外显子和8个内含子,其编码蛋白为高迁移率蛋白家族成员,能参与基因调控等生理过程;TOX基因在白血病细胞系Jurkat和Raji中高表达,并定位于细胞核中;对细胞生长曲线绘制及细胞周期分析表明,TOX能够使细胞生长速度加快,且S期细胞比例明显上升.说明TOX参与了细胞增殖调控,有可能研究开发为药物靶标或疾病标志物.

ADME/Tox体外模型结合LC/MS法在中药研究中的应用

由于中药及其复方化学成分的复杂性和作用环节及作用靶点的多重性。要完全阐明中药作用的物质基础和作用机制是有困难的,利用ADME/Tox体外模型及LC/MS等现代分析方法对中药进行研究有其特点和优势,目前对中药的ADME/Tox体外模型还没有建立起一个完整的实验体系,本文对国内外常用于ADME/Tox研究的体外模型进行了综述,以期为中药的ADME/Tox体外研究提供一个思路。

靶向调控TOX3基因对乳腺癌细胞增殖及周期的影响

目的研究TOX3基因对人乳腺癌细胞增殖能力及细胞周期的影响。方法采用Western blot法检测已构建的稳定沉默TOX3的ZR-75-1细胞和稳定过表达TOX3的MDA-MB-231细胞中TOX3蛋白的表达。MTT法检测过表达和干扰TOX3基因对乳腺癌细胞增殖活性的影响。平板单克隆实验检测过表达TOX3对MDA-MB-231细胞单克隆形成能力的影响,流式细胞术检测沉默或过表达TOX3后ZR-75-1和MDA-MB-231细胞周期的变化。结果与阴性对照组比较,稳定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1细胞TOX3蛋白表达明显下降,过表达TOX3的MDA-MB-231细胞TOX3蛋白表达明显上调。过表达TOX3后,MDA-MB-231细胞的增殖活性明显增强,单克隆形成能力增强,G 0/G 1期细胞所占比例明显减少,G 2/M期细胞比例增多。干扰TOX3后,ZR-75-1细胞增殖活性下降,G 0/G 1期细胞比例增加,G 2/M期细胞比例减少。结论靶向调控TOX3基因的表达可改变乳腺癌细胞增殖和单克隆形成能力,影响乳腺癌细胞周期。

不良妊娠结局CT、UU、HCMV、TOX感染分析

为了探讨CT、UU、HCMV、TOX感染、重叠(或同时)感染致不良妊娠结局。采用血清流行病学调查等方法,对不良妊娠孕产妇150例,同期随机抽取正常孕产妇74例进行对比观察。结果不良妊娠孕产妇CT检出率24.67%,UU检出率20.67%,HCMV检出率84.67%,TOX检出率22.0%,均显著(或非常显著)高于对照组,且两种以上病原微生物重叠(或同时)感染率为36.0%,与对照组相比具有非常显著性差异(P<0.001)。结论上述四种病原微生物感染均可致不良妊娠的发生,重叠(或同时)感染致不良妊娠危险性明显大于单一感染者,提示预防孕期(特别是孕早期)感染是十分重要的,应纳入妇幼保健工作的重要内容来抓。

多参数TOX免疫表型法的建立及在母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤中的应用

目的:建立多参数流式检测胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)在PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞中的免疫表型法,以及其在1例罕见CD4-CD56^(+)表型的血液恶性肿瘤母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)患者中的应用分析。方法:收集1例BPDCN患者骨髓(BM)和外周血(PB),2例非肿瘤手术患者和1例健康者BM以及11例健康者(HI)PB分别作为BM和PB对照组,利用多色流式单抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TOX、PD-1、Tim-3、CD244及相应同型对照进行流式细胞检测。结果:流式检测结果提示,BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)CD3^(+)、TOX^(+)CD4^(+)和TOX^(+)CD8^(+)T细胞比例均比对照组升高;BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)PD-1^(+)CD8^(+)、TOX^(+)Tim-3^(+)CD8^(+)和TOX^(+)CD244^(+)CD8^(+)耗竭性T细胞中的分布比例也显著高于对照组。此外,在BPDCN患者BM和PB的CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg细胞中TOX^(+)细胞分布比例高于对照组;同时TOX^(+)细胞在PD-1^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg、Tim-3^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg和CD244^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg耗竭性T细胞中的分布比例也明显高于对照组。结论:成功建立多参数流式细胞术检测PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞亚群中TOX免疫表型法,TOX可能是BPDCN患者T细胞免疫调节的重要转录因子。

昆虫特异性神经毒素基因tox34的合成及转基因烟草的获得

对来自虱状蒲螨（Pyemotestritici）的昆虫特异性神经毒素基因tox34编码成熟蛋白部分的762bp片段，依据植物的偏爱密码子进行了序列改造。将改造后的基因插入细菌表达载体pBV221，经热诱导处理后细菌总蛋白在SDS-PAGE上特异条带的表观分子量为32～33kD。将tox34基因插入植物高效表达载体后以根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens（SmithetTownsend）Conn）介导的方法导入烟草（NicotianatabacumL．cv．SR1），并获得了转基因烟草植株。经PCRSouthem杂交结果证实，完整的毒素基因已整合入烟草基因组。转基因幼苗根部的组织化学检测GUS显示阳性。再生植株叶片的棉铃虫（HeliothisarmigevaHubner）饲喂实验显示对低龄幼虫有很好的毒杀作用。