RPAP3蛋白中TPR结构域的功能研究

目的:构建针对RPAP3 TPR区域的慢病毒载体,观察过表达对细胞周期的影响。方法:通过生物信息学软件比较RPAP3结构域组成,推测功能;分析RPAP3核定位信号,构建瞬时表达质粒pEGFP-N2-RPAP3,激光共聚焦显微镜观察RPAP3蛋白的亚细胞定位;通过酵母双杂交和GST-Pulldown实验研究RPAP3与HSP70的相互作用及作用靶点;构建慢病毒载体pLJM.1-RPAP3,转染293T细胞,收病毒感染MCF7细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞系,流式细胞分析对细胞周期的影响。结果:RPAP3在多物种广泛存在,有高度保守性;蛋白存在典型核定位信号,激光共聚焦显微镜下,GFP标记的RPAP3蛋白主要分布在细胞核;酵母双杂交和GST-Pulldown实验证实RPAP3与HSP70间存在相互作用,且作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和HSP70的GPTIEEVD末端之间;流式细胞显示RPAP3 TPR区域的高表达阻滞细胞周期且凋亡增加。结论:RPAP3与HSP70间的相互作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和热休克蛋白70的GPTIEEVD末端之间;构建高表达细胞株发现其对细胞周期及凋亡有影响。

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。

NsdB——天蓝色链霉菌A3(2)中一个负调控抗生素产量蛋白的研究(英文)

TPR(tetratricopeptide repeat)是在很多蛋白中均被发现到的一个含有34个氨基酸的蛋白重复序列,其基本功能是参与蛋白间的相互作用。天蓝色链霉菌A3(2)中有70个蛋白含有类TPR结构域,NsdA是其中的一个,研究发现该蛋白对天蓝色链霉菌的产孢和产素都有负调控作用。本研究中发现基因SCO7252和SCO1593编码含TPR结构的蛋白,中断SCO7252基因后菌株放线紫红素和钙依赖抗生素产量均提高,但形态分化没有明显变化,基因SCO1593中断后菌株在产孢产素及形态等各方面均未受到影响。基因SCO7252被命名为nsdB,RT-PCR分析表明,该基因在生长30h时开始表达。通过生物信息分析表明,天蓝色链霉菌的70个含类TPR结构的蛋白中有32个仅含该结构域,有25个另外含有DNA结合区域,这些暗示着它们可能直接控制基因的表达。

SGT蛋白在小鼠脑发育过程中的表达(英文)

目的通过研究SGT蛋白在小鼠脑发育过程中的表达来揭示该蛋白在小鼠脑发育阶段中的重要性。方法分别运用定量RT-PCR以及Western blot实验方法来检测小鼠全脑中SGT核酸和蛋白的表达情况。用Westernblot实验方法检测SGT蛋白在海马,皮层,纹状体和小脑中的表达模式;运用免疫组化方法来检测SGT蛋白在小鼠脑分区中的亚细胞定位。结果在小鼠全脑中,SGT的核酸和蛋白水平均表现为出生早期的高表达,到了成年期,表达水平下降。SGT蛋白在海马,皮层,纹状体和小脑中的表达模式和在全脑中的类似。免疫组化结果显示,在出生后14天(P14)的小鼠脑切片中,SGT蛋白在海马的CA区域以及皮层和纹状体都有强的阳性表达。在小脑中,SGT蛋白主要分布在浦肯野细胞层。在同样的检测条件下,SGT蛋白在成年期小鼠的脑切片中没有明显的阳性表达。结论我们的研究首次揭示了SGT蛋白在小鼠脑发育过程中的表达,为进一步揭示SGT在中枢神经系统中的功能提供了一个参考依据。

家蚕中一未知基因的生物信息学分析

对家蚕中一未知基因进行生物信息学分析,结果显示:该基因开放阅读框大小为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量为31.1kD,等电点为4.75;该基因编码蛋白含有TPR(Tetratrico Peptide Repeat)结构域,具有个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、肉豆蔻酰基化位点、糖基化位点及cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化功能位点。

CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达载体,以实现这些基因在真核细胞中的高效表达,为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法:从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA,以此为模板,采用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)获得CHIP全长编码基因,经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tag1中,并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box(-)。结果:钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致,瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论:成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体,为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。