B型禽偏肺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用

试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方法用于临床样品的检测。结果显示:建立的TaqMan荧光定量PCR方法只能检测出B亚型aMPV,其敏感性能达到1.34×10^(1) copies/µL,斜率为-3.346,截距为40.01,相关系数(R2)为1.00,循环阈值(Ct)与模板拷贝数之间呈现良好的相关性;临床样品检测结果显示,该方法检测出18份样品阳性,而普通PCR仅检测出10份阳性。综上所述,建立的aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法在样品检测中表现出良好的特异性和较高的敏感性,适用于临床样品的aMPV-B检测。

鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查.

鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。

牛结节性皮肤病病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和重复性。结果发现,本方法敏感性达到15 copies/μL,不与其他牛病病毒和山羊痘弱毒疫苗AV41发生反应,变异系数均小于3%。用本方法和OIE推荐的普通PCR方法检测发病牛场94份临床样品,LSDV检出率分别为62%和37%,其中阳性样品2种方法检测符合率为96.7%,说明本方法敏感性、特异性和重复性较好,可用于LSDV检测。

鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。

猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

为了建立一种猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)TaqMan实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中6株PSV的基因组序列设计合成特异性引物和探针,优化扩增体系和程序,并完成敏感性试验、特异性试验、重复性试验及PSV阳性样品的检测。结果表明:优化后的特异性引物和探针浓度均为0.8μmol/L、退火温度为55℃;建立的PSV TaqMan实时荧光定量PCR方法的最低检测限为5×10~1拷贝/μL,TaqMan实时荧光定量PCR方法的敏感性比普通PCR方法高100倍;仅以PSV阳性质粒为模板进行的TaqMan实时荧光定量PCR检测有扩增曲线,其他对照病毒样品均未发生扩增;组间与组内变异系数均低于1%;对30份阳性病料进行检测,扩增结果均为阳性。说明试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法敏感性、特异性、重复性好,可用于PSV的临床检测。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

为建立可快速鉴别牛结节性皮肤病病毒(LSDV)与山羊痘病毒(GTPV)的方法,通过对GenBank中公布的LSDV和GTPV的全基因序列进行比对分析,靶向LSDV基因组的保守区域设计了1对特异性的引物和2条TaqMan探针,经反应条件优化后,建立了一种LSDV和GTPV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并评估其敏感性、重复性、特异性。结果表明,本方法能从LSDV、GTPV、绵羊痘病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒6种常见的牛源性疾病病原中成功鉴别LSDV和GTPV,具有良好的特异性。LSDV和GTPV基因组的最低检测下限都为3.37×10~1copies/μL。组内、组间变异系数均小于1%。运用本方法对10份临床样品进行检测,符合率达到100%。综上所述,本方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可快速鉴别出样品中的LSDV和GTPV,解决了目前国内容易造成的牛结节性皮肤病漏诊的问题,为全面控制国内牛结节性皮肤病疫情提供了新的技术手段。

鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步评价

目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检测,对其他细菌无特异性扩增曲线。该检测方法基因拷贝数的检出限为3.8 copy/μL。批内变异系数在0.20%~2.01%,批间变异系数在0.71%~2.57%,具有较高的可重复性。采用qPCR检测临床标本,其灵敏度明显高于血培养检测,可对患者做出准确、及时的诊断。结论该实验建立的TaqMan qPCR检测方法能有效、快速准确地检测布鲁氏菌感染。

猪圆环病毒3型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】通过分析明确PCV3复制相关蛋白Rep基因特征,设计针对Rep基因的特异性引物和探针,经条件优化后建立检测PCV3感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【结果】建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法敏感性好,最低检测限为42.2拷贝·μL-1;特异性强,对常见猪群传染病均无交叉反应;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均在1.48%以内。对福建省2014年至2018年保存的193份组织样品进行检测发现,PCV3在福建省猪群中存在较高的阳性感染率(65.80%),且和PCV2混合感染率较高(52.85%)。【结论】本方法的建立为开展Rep基因在PCV3复制和感染过程中的作用机制提供检测方法。

鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。

尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立

尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。