慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。

慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内转移对帕金森病大鼠模型的保护作用

目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素反式作用子rtTA2s-M2病毒共同注射到SD大鼠左侧纹状体,用强力霉素(DOX)诱导大鼠目的基因GDNF和TH的表达。1周后在大鼠的同侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁纹状体的DA能神经元。通过旋转行为、黑质TH免疫组化染色以及高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)检测纹状体DA含量评估其保护效应;通过RT-PCR、免疫印迹观察Lv-TH-GDNF在脑内的表达。实验与健康对照组、磷酸缓冲液(PBS)对照组进行比较。结果在6-OHDA损伤后4周,Lv-TH-GDNF+rt-TA2s-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡诱发的旋转效应均明显低于PBS对照组(P<0.01),损毁侧的的黑质区TH阳性细胞表达强度、纹状体DA含量均明显高于PBS对照组(P<0.01),但二者均低于健康对照组(P<0.01)。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+DOX组大鼠纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高(P<0.01)。结论慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内直接转移,在强力霉素诱导下可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,具有保护作用。

Tet-on系统诱导表达c-myc转基因小鼠的建立

从Hela细胞RNA中通过RT-PCR扩增出c-myc基因的cDNA,将c-myc cDNA克隆入Tet-on系统的反应元件pTRE2载体,与含有Tet-on系统的调控元件pBC-rtTA基因混合显微注射到FVB小鼠受精卵的雄原核中,共注射603枚卵,将注射后存活的263枚卵移植到21只假孕母鼠输卵管内,有17只怀孕,共产仔59只。PCR和Southern blotting检测有2只双基因阳性公鼠和1只c-myc单基因阳性公鼠。3只公鼠的F1代PCR检测表明,其携带的c-myc外源基因均具有遗传性。

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。

利用Tet-On系统构建稳定表达Pdx1的小鼠ESC细胞株

目的:利用Tet-On系统构建稳定表达胰十二指肠同源异形框1(Pdx1)的小鼠胚胎干细胞(ESC)株,为进一步研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化奠定了基础。方法:采用Tet-On系统构建具有绿色荧光蛋白标记及嘌呤霉素抗性的Pdx1过表达慢病毒载体并感染胚胎干细胞。实验分为空白对照组(ESC组)、空载慢病毒对照组(PDX1−ESC组)和Pdx1慢病毒转染组(PDX1+ESC组)。流式细胞术检测多西环素(DOX)筛选后转染细胞的阳性率;检测Tet-On系统功能及Pdx1的mRNA和蛋白表达。流式细胞分选仪分选转染细胞,构建稳定表达Pdx1基因的ESC株及阴性对照ESC株。结果:(1)DOX筛选后PDX1−ESC组的转染细胞阳性率为90.72%,PDX1+ESC组的转染细胞阳性率为94.01%。用流式细胞分选仪分选后PDX1−ESC组的转染细胞阳性率为97.84%,PDX1+ESC组为98.13%。(2)加入DOX后,PDX1−ESC组和PDX1+ESC组可见绿色荧光。PDX1+ESC组Pdx1的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05)。不加DOX,则3组细胞均未见绿色荧光,且Pdx1 mRNA和蛋白表达的差异无统计学显著性(P>0.05)。(3)细胞株冻存3个月后复苏培养仍然存活,并受DOX调控。结论:利用Tet-On系统成功构建可诱导表达Pdx1的小鼠ESC株,为研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化提供了有效的细胞模型。

基于Tet-on系统的RFP基因表达载体构建及功能验证

【目的】构建四环素诱导表达调控系统的表达载体,并对其功能进行验证。【方法】利用pTRE-tight和pdsred-Express2-N1构建带有红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)基因的载体pTRE-DSred,用其与另一载体pTet-on共转染293T细胞,并加入不同质量浓度(0,0.1,1,10μg/mL)的强力霉素(doxycycline,DOX)诱导,以未经质粒转染的293T细胞为对照组,在荧光显微镜下观察RFP基因的表达情况。【结果】成功构建了pTRE-DSred重组质粒,将其与pTet-on质粒共转染293T细胞,在细胞培养液中分别添加0.1,1,10μg/mL DOX,48h后均有红色荧光蛋白的表达,但10μg/mL DOX组红色荧光蛋白的表达水平明显低于前2个组;0μg/mL DOX诱导组中也有红色荧光蛋白表达,但水平极低;在未转染质粒对照组中未观察到红色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,pTREDsred和pTet-on共转染组均检测到RFP基因的转录。【结论】成功构建了Tet-on系统RFP基因表达载体,适宜质量浓度的DOX诱导有助于目的基因的高水平表达,但在不添加DOX诱导剂时,该Tet-on系统存在目的基因低渗漏表达现象。

Adeno-X Tet-On系统调控LacZ基因在雪旺细胞中表达的研究

目的 应用Adeno XTet On系统感染雪旺细胞 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控LacZ基因产物 (βgal)的表达。方法 ①取生后 5～ 6dSD仔鼠坐骨神经进行雪旺细胞培养 ,并进行形态学及S 10 0蛋白相关抗原免疫组织化学染色鉴定。②将Adeno XTet OnVirusStock与Adeno XTRE βgalVirusStock分别感染HEK2 93细胞 ,收获病毒并作滴度测定。③将扩增后的病毒感染雪旺细胞并绘制Dox调控下βgal诱导表达曲线。结果 ①由体外培养获得的雪旺细胞纯度可达 90 %以上并且状态良好 ,免疫组织化学染色阳性结果明显。②扩增后的病毒滴度较高 ,分别达 1.2 6× 10 9、1.99× 10 9pfu/ml。 结论 将病毒感染雪旺细胞后 ,经检测发现DOX对

利用Tet-on系统构建调控APP_(swe)基因表达的SH-SY5Y细胞模型

目的利用Tet-On诱导可调控系统构建表达淀粉样前体蛋白突变基因(APPswe)细胞模型。方法构建重组质粒p TRE-APPswe-Flag,利用慢病毒将其包装转染SH-SY5Y细胞。Puromycin筛选72 h后,通过强力霉素诱导,Western blot检测验证,免疫荧光检测APPswe表达情况。结果强力霉素诱导后,筛选的细胞Western blot检测Flag标签蛋白表达明显,免疫荧光显示APPswe蛋白表达增加;撤掉强力霉素后,APPswe蛋白表达减少。结论成功构建了可调控Tet-OnAPPswe表达SH-SY5Y细胞系统模型。

Tet-on系统对胰岛细胞瘤中TRB3基因的表达调控作用

目的构建Tet-on系统可控表达TRB3基因的胰岛细胞瘤细胞株。方法通过Tet-on系统将TRB3质粒转染INS-rβ(r9)细胞中,经潮霉素筛选,克隆扩增得到可诱导表达TRB3基因的细胞系。采用实时定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western Blot检测该基因表达的可诱导性。结果三种检测方法都显示,500ng/mlDOX诱导48h可使转染的r9细胞中TRB3基因表达达到峰值,mRNA表达可上调60倍。结论通过本研究结果得到可控的TRB3高表达细胞株,为进一步研究该基因在胰腺肿瘤细胞中的功能提供了良好的细胞模型。

Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠的制备

建立Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠模型,构建转基因表达载体,经细胞诱导表达验证后,酶切得到含有CUEDC2的线性DNA片段,并采用显微注射的方法及后续筛选鉴定,得到CUEDC2转基因小鼠。进而通过与乳腺特异表达的MMTV-rtTA转基因小鼠交配,得到CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。利用2 mg/mL的多西环素(Doxycycline)诱导小鼠体内CUEDC2表达。通过Western Blot、免疫组化检测表达。结果表明经诱导CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠的2个Founder的F1、F2代在转录水平和蛋白水平均成功表达CUEDC2,并具有乳腺特异性。表明Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠制备成功。为后续CUEDC2的功能研究奠定了技术基础。

基于Tet-On系统构建Alb启动子调控猪uPA转基因表达的慢病毒载体

目的应用Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控小型猪uPA (pig urokinase-type plasminogen activator,puPA)基因表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG)。方法首先将pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Xho I/Xba I双酶切的pLVX-TetOne中,获得Alb启动子替换pLVX-TetOne原有的PGK启动子的质粒pLVX-Alb-TetOne;接着以pCD823 A-1为模板,PCR扩增T2A-CopGFP,In-Fusion克隆至BamH I/Age I酶切的pLVX-Alb-TetOne中,获得pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG);最后以H8803为模板,PCR扩增puPA(3′端含Flag标签),In-Fusion克隆至pLATTTG中,最终获得慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP (pLATTPUTG);所构建的质粒均经酶切和测序鉴定。pLATTPUTG瞬转293T细胞,转染24 h后倒置荧光显微镜检测绿色荧光;随后六孔板内加入强力霉素(Dox),48 h后倒置荧光显微镜下检测CopGFP表达(包括未加Dox的孔),接着收集细胞以抽提总RNA和总蛋白,以用于qRT-PCR检测puPA和CopGFP表达及Western blot检测Flag表达。结果酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体pLATTPUTG。pLATTPUTG转染293T细胞,24 h后倒置荧光显微镜下未见绿色荧光,而加入Dox 48 h后几乎所有细胞均发强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然未见绿色荧光;加Dox的孔内细胞上puPA、CopGFP和Flag表达水平均显著升高,而不加Dox的孔内细胞上检测到上述基因极低表达;以上数据提示,应用该Tet-On基因表达调控系统实现了puPA基因在293T细胞上可诱导性表达。结论成功基于Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控puPA转基因表达的慢病毒载体pLATTPUTG,这为相关后续研究奠定了坚实基础。

基于PiggyBac转座系统的低溢漏诱导型Tet-On过表达体系的建立及应用

为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达,本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度.

Tet-on基因表达系统反应质粒P^(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板,进行RT-巢式PCR,获得HIF-1α的cDNA,克隆入Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE2hyg,酶切重组子鉴定。将构建好的PTRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2Tet-on细胞,在强力霉素的作用下,用RT-PCR及Westernblot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的cDNA测序结果与Genbank记载完全一致,并成功克隆入PTRE2hyg,将反应质粒PTRE-HIF-1α转入HepG2Tet-on细胞,可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α,并证明其表达能在HepG2Tet-on细胞中受强力霉素调控。

Tet-on系统诱导COX1基因在小鼠前脂肪细胞3T3-L1中的表达

目的利用Tet-On诱导表达系统,调控目的基因环氧化酶(COX)的表达,探讨COX对脂肪细胞分化的作用,为进一步深入研究肥胖的致病机制奠定理论基础。方法脂质体介导调控质粒pTet-On转染3T3-L1细胞,G418筛选单细胞克隆,RT-PCR法检测四环素反应转录活化因子(rtTA)基因的整合;pTRE-Tight-Luc质粒瞬时转染含rtTA基因的细胞克隆,强力霉素(DOX)诱导表达后检测荧光素酶活性,筛选出高效表达的抗性克隆,命名为3T3-L1-Tet-On-26#;构建重组质粒pTRE-Tight-COX1,双酶切鉴定后测序,将测序正确的重组质粒瞬时转染3T3-L1-Tet-On-26#细胞克隆,免疫荧光检测COX1的表达。结果建立了3T3-L1-Tet-On细胞模型;成功构建了pTRE-Tight-COX1重组质粒,瞬时转染3T3-L1-Tet-On-26#,DOX诱导后COX1表达显著升高。结论诱导表达细胞株3T3-L1-Tet-On的建立为COX1功能基因的研究提供了平台。

利用Tet-on诱导基因表达系统构建EID3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立

目的构建类E1A细胞分化抑制因子3(EID3)真核表达载体,并转染人乳腺癌细胞(MCF-7),建立Tet-on诱导表达的目的基因EID3的稳定转染细胞系。方法应用PCR技术,得到目的基因EID3的c DNA,通过双酶切、胶回收方法纯化目的片段EID3。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体p LVuTight-Puro,经菌落酶切、电泳以及测序鉴定。将真核表达质粒p LVu-Tight-Puro-EID3和p LVX-Tet-On Advanced Vector转染MCF-7细胞,分别通过G418和嘌呤霉素选择培养,建立由四环素(doxycycline,DOX)诱导表达的稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测目的基因EID3在DOX诱导下mRNA以及蛋白的表达。结果成功构建了p LVu-Tight-Puro-EID3表达质粒,并建立了由DOX诱导表达的稳定转染细胞系,可在DOX诱导下稳定表达EID3基因的mRNA及蛋白。结论人EID3稳定表达细胞系为研究EID3基因在肿瘤辐射敏感性及药物敏感性的作用提供实验基础。

利用Tet-On系统敲低PRDM5对BEAS-2B细胞增殖的影响

[目的]探讨利用dox诱导的Tet-On调控系统敲低PRDM5基因对人正常支气管上皮细胞BEAS-2B增殖的影响。[方法]构建敲低PRDM5基因的pLKO-Tet-On-PRDM5-shRNA慢病毒质粒,包装生产慢病毒并转染BEAS-2B细胞,以相同条件制备转染pLKO-Tet-On-control-shRNA的BEAS-2B细胞作为对照。WesternBlot法检测PRDM5蛋白的表达水平;MTT实验观察细胞增殖情况;平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡水平。[结果]在合适剂量的dox诱导下(0.5μg/mL),敲低组细胞中PRDM5蛋白表达明显低于对照组(P<0.05);各时间点OD值高于对照组(P<0.05);克隆形成数大于对照组(P<0.01);凋亡率低于对照组(P<0.01)。[结论]成功构建出Tet-On系统调控敲低PRDM5的BEAS-2B细胞系。PRDM5基因敲低可促进BEAS-2B细胞增殖并且抑制其凋亡。

EphA1基因可控性双稳转内皮祖细胞系EPCs^(Tet-On-EphA1)SiRNA的建立

目的建立可调控EphA1基因表达的内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA。方法将pWHE146质粒转染到内皮祖细胞系中,筛选出稳定表达的细胞克隆;扩增后瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒,强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶活性,挑选出高表达、低背景的受强力霉素调控的EPCsTet-On细胞株;再将重组质粒pTRE-EphA1SiRNA转染入EPCsTet-On细胞株,筛选出稳定表达细胞克隆EPCsTet-On-EphA1SiRNA;通过强力霉素诱导后,利用RT-PCR和Western blotting法检测EphA1基因mRNA与蛋白的表达。结果成功构建了受强力霉素调控的高表达低背景的EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株;强力霉素可诱导EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株中EphA1mRNA表达下调,较之未调控组其差异有统计学意义(P<0.05);强力霉素调控EphA1蛋白表达的能力在一定范围内呈剂量依赖性关系。结论成功建立强力霉素调控EphA1基因表达的大鼠双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA,为深入研究EphA1基因在内皮祖细胞参与肝癌血管生成过程中的作用提供了有效的实验手段。

基于dCasMINI蛋白的CRISPRi工具设计及其效果探究

目的探索基于去活化CasMINI蛋白(dCasMINI)的CRISPR干扰(CRISPRi)工具设计及其转录抑制效果评估。方法采用四环素诱导基因开启系统(tet-on),流式细胞测量术和实时荧光定量反转录聚合酶链反应从质粒基因、基因组外源性基因位点和内源性基因位点三个层次评估dCasMINI系统在哺乳动物细胞中的转录抑制效果,并进一步设计和比较6种dCasMINI-CRISPRi工具(dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2)和不同位置单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)的转录抑制效果。结果dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制质粒基因、基因组外源性基因的转录(P<0.05);dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制内源性基因的转录(P<0.05);不同结合位点的sgRNA具有不同的转录抑制效果(P<0.05)。结论CasMINI系统能够改造成多种CRISPRi工具进行基因敲降研究,未来有望应用在多个场景,如原代细胞表观基因编辑、体内筛选和临床治疗等。

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。【结论】利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。

Tet-on控制的Luciferase和SupF突变报告基因质粒的构建及其在顺铂致突变作用中的应用研究

目的研究TCR在顺铂导致的细胞内DNA损伤和突变过程中的分子机制,并为进一步研究转录偶联修复与突变发生的分子机制提供重要分子生物学依据。方法首先将SupF突变报告基因克隆到带有双向真核启动子的含有Tet调控元件TRE的表达载体pBI-L的多克隆位点(MCS)上,获得pTCR-1,再将SV40ori元件插入pTCR-1载体,最终获得pTCR-2质粒。酶切和DNA测序证实后,用顺铂将pTCR-2进行体外DNA损伤后瞬时转染至Tet-on293细胞,在Dox诱导下培养48h,从细胞内提取质粒,纯化后转化SY204菌株,蓝白斑筛选挑取白色突变斑,计算突变频率并进行DNA测序检测突变频谱。结果经酶切鉴定和测序分析,插入片段长度和序列正确。在Dox诱导下取得了SupF报告基因在转录偶联修复途径中的突变频率与频谱。结论重组的pTCR-2质粒具有在真核细胞中Tet启动的转录活性,应用于顺铂致突变研究中,使转录条件下的突变情况能够得以反映。