Toll样受体9基因rs187084和rs352140位点多态性与Hp感染及其相关疾病易患性的关系

目的探讨Toll样受体9（Toll-like receptors 9,TLR9）基因rs187084和rs352140位点多态性与幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染以及相关疾病的关系。方法收集2012年12月到2013年6月在武汉大学人民医院内镜中心进行胃镜活检的患者326例,同时采集患者外周血标本。用胶体金免疫分析法检测患者外周血中抗Hp抗体。用等位基因特异性聚合酶链式反应（allele specific polymerase chain reaction,AS-PCR）方法检测TLR9基因rs352140和rs187084位点基因多态性。结果TLR9基因rs187084位点和rs352140位点CC、TT和CT各基因型在抗Hp抗体阳性组和阴性组中的分布差异均无统计学意义（χ2=3.91,0.90;P=0.14,0.64）;TLR9基因rs187084和rs352140位点各基因型在正常胃黏膜组织组与Hp感染相关疾病组中的分布差异均无统计学意义;在分析rs187084位点时,基因型频率的相对风险分析显示,CC基因型患胃癌的风险是TT和CT基因型的2.46倍（OR=2.46,95%CI：1.01~6.01,P=0.04）。结论 TLR9基因rs187084和rs352140位点多态性与Hp感染可能无相关性;rs187084位点CC基因型可能是胃癌发病的危险因素。

赤眼鳟Toll样受体9基因的cDNA全长克隆及表达特性分析

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Toll样受体9基因(toll–like receptor 9,ScTLR9)的结构特性及其参与免疫应答草鱼呼肠弧病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染时的表达特性,采用RACE技术克隆Sc TLR9基因c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术比较分析ScTLR9免疫应答GCRV的表达特性。结果显示:ScTLR9的cDNA全长为3 687 bp,编码1 059个氨基酸,有17个富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeats,LRRs)结构域。ScTLR9在被检测的9个组织中均有表达,在中肾和头肾中的表达量最高;感染GCRV后,基因TLR9在赤眼鳟和草鱼头肾中的表达量均上调,在赤眼鳟头肾中的表达量于感染后12 h达到峰值,推测TLR9参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答,且在抗GCRV入侵免疫反应中赤眼鳟较草鱼的免疫应答更为迅速。

系统性红斑狼疮患者Toll样受体9基因多态性的初步研究

目的研究Toll样受体9(TLR9)基因在系统性红斑狼疮(SLE)中是否存在多态性。方法提取26例SLE患者mRNA并逆转录为cDNA,扩增产物经3730 DNA自动测序仪测定TLR9基因序列。结果TLR9 mRNA自起始位点起第1783、2269和3222位碱基存在二态性(A或G),这3个位点为单核苷酸多态性(SNP)位点,分别称之为SNP1、SNP2和SNP3,其中SNP1是我们新发现的多态性位点,SNP2和SNP3为美国国立生物技术信息中心(NCBI)SNP数据库中公布的位点,它们均不改变氨基酸编码。SNP2在人群中可表现为AA纯合、GG纯合或AG杂合3种基因型,在SLE患者中以AG型为主(50%),而在正常人中以GG型为主(75%)(P<0.05);SNP1和SNP3只在一名男性SLE患者中发现,表现为AG杂合,其余个体均为GG纯合。结论TLR9基因编码区中的一个单核苷酸多态性与SLE发病相关联。

人Toll样受体9基因启动子区的生物信息学分析

目的:探讨人Toll样受体9(TLR9)基因启动子区序列特征。方法:利用生物信息学技术预测人TLR9基因启动子区域、转录因子结合位点和CpG岛分布。结果:人TLR9基因启动子区有1434个转录因子结合位点,人和小鼠保守区域内存在23个共同的转录因子结合位点,人TLR9基因启动子区包含长572 bp的CpG岛。结论:人TLR9基因启动子区相关生物信息学的研究,提高了针对启动子的研究效率,并为预测基因启动子的功能提供了重要信息。

小鼠Toll样受体9基因的克隆、表达及其活性的初步鉴定

从小鼠巨噬细胞中提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增小鼠Toll样受体9(mTLR9)cDNA,构建真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7.1-mTLR9,转染293T细胞,利用Western Blotting检测蛋白表达,并用双荧光素酶报告基因系统检测mTLR9对其介导的信号通路下游转录因子NF-κB转录活性影响.结果表明,本试验成功克隆到小鼠TLR9cDNA,构建的重组体转染细胞后表达的蛋白分子质量与预计相符,并能激活下游转录因子NF-κB的转录活性.

Toll样受体9基因多态性与口腔扁平苔藓治疗及预后的关系研究

口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）为病因不明的口腔黏膜慢性炎症性疾病,并被世界卫生组织（WHO）列为癌前病变。我国人群总患病率为1.27%,其中男性0.96%,女性1.57%,多发生于更年期妇女。OLP病损多发生于颊黏膜处,舌背部也可发生,多对称分布。临床可分为普通型和糜烂型2种。OLP病程慢性迁延,尤其是糜烂型OLP,患者自觉疼痛和吞咽困难,复发率高,有癌变风险。

Toll样受体9基因多态性与重症肌无力相关性研究

目的探讨Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)基因rs352140和rs187084位点多态性与重症肌无力(myasthenia gravis,MG)的相关性。方法纳入109例MG患者和162例健康体检者。采用聚合酶链反应-限制性内切酶多态性方法对TLR9基因rs352140和rs187084位点分型,并在MG组与对照组、MG各亚组(性别、发病年龄、胸腺情况、最严重时Osserman分型、Oosterhuis评分和激素近期疗效)与对照组、MG各亚组之间比较两位点等位基因频率和共显性、加性、过显性遗传模型下基因型频率的差异。结果 TLR9基因rs352140和rs187084位点等位基因频率和共显性、加性、过显性遗传模型下的基因型频率在MG组与对照组、MG各亚组与对照组及MG各亚组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TLR9基因rs352140和rs187084位点多态性与重症肌无力的易感性、严重程度和激素疗效无相关性。

梅花鹿天然Toll样受体9基因克隆与序列分析

Trizol法提取梅花鹿肝脏总RNA，采用ORF两端兼并引物，RT—PCR方法克隆梅花鹿天然Toll样受体9基因（TLR9）并进行系统的生物信息学分析。RT—PCR结果显示，梅花鹿TLR9基因的mRNA长4043bp，含有800bp左右的5’UTR，

寻常型银屑病患者外周血单个核细胞Toll样受体9基因和血清IL-20表达水平的研究

目的:探讨寻常型银屑病患者外周血单个核细胞Tol l样受体9基因表达和血清I L-20表达水平及两者之间的相关性。方法:采集32例寻常型银屑病患者及30例健康正常人外周血,分别采用荧光实时定量PCR法检测外周血单个核细胞TLR9 mRNA表达,双抗体夹心ELISA法检测血清IL-20的表达水平。结果:银屑病组TLR9 mRNA的表达为(1.361±0.041)较正常人对照组(0.857±0.027)明显增高,在统计学上差异有显著性(P<0.01)。银屑病组IL-20表达水平为(30.73±21.84)×10-3g/L,较正常人对照组(13.56±7.17)×10-3g/L明显增高,在统计学上差异有显著性(P<0.01)。且银屑病患者外周血单个核细胞TLR9 mRNA表达与血清IL-20水平呈正相关,r=0.7239。结论:TLR 9及IL-20可能在银屑病发病过程中起重要作用。

克隆人Toll样受体9基因和转染真核细胞对CpG的反应

目的克隆人Toll样受体9(TLR9)基因,重组入真核表达载体,转染真核细胞,检测对CpG的反应。方法利用逆转录PCR从人外周血mRNA扩增TLR9基因;TLR9基因定向重组入真核表达载体pcDNA3.0;利用磷酸钙转染方法导入肝癌细胞系SMMC7721,经G418培养筛选,克隆出携有人TLR9 CDNA的细胞系;用不同的CpG刺激转染的细胞系观察生长率。结果逆转录PCR扩增出3.0 kb的DNA片段,经TA克隆和细胞DNA序列分析为人TLR9基因全序列;利用定向克隆的方法将人TLR9基因成功重组入pcDNA3.0。结论制备的SMMC7wgq-TLR9系可以用于CpG研究。

Toll样受体9基因多态性与湖北汉族系统性红斑狼疮易感性的关系

目的:明确Toll样受体9基因rs187084、rs352140位点单核苷酸多态性与湖北汉族人口中系统性红斑狼疮疾病易感性的关系。方法:PCR扩增80例系统性红斑狼疮患者和84例健康志愿者的外周血目的基因片段,通过SNaP shot法检测rs187084、rs352140这两个位点的基因型及等位基因频率。结果:系统性红斑狼疮实验组及健康对照组中rs187084的AA,GG,AG基因型频率分别为37.50%,18.75%,43.75%和47.62%,13.10%,39.29%,无显著统计学差异(P> 0.05)。rs352140 AA,GG,AG基因型频率在实验组及对照组中分别为18.75%,43.75%,37.50%和11.90%,48.81%,39.29%,无显著统计学差异(P>0.05)。结论:Toll样受体9基因rs187084、rs352140基因位点的单核苷酸多态性可能与系统性红斑狼疮的发病不相关。

猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测

本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9)。基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切。

Toll样受体9基因启动子单核苷酸多态性与儿童变应性哮喘的相关性

目的 研究Toll样受体9（toll-like receptor 9,TLR9）基因启动子区单核苷酸多态性在浙江汉族儿童中的分布,探讨其与哮喘易感性及其表型之间的相关性.方法 对312例变应性哮喘患儿（哮喘组）和339名健康儿童（对照组）采用DNA直接测序法检测TLR9基因-1486（rs187084）和-1237（rs5743836）单核苷酸多态性;采用ELISA法检测两组不同基因型血清干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素12（interleukin-12,IL-12）和白细胞介素4（interleukin-4,IL-4）水平;采用化学发光法检测血清总免疫球蛋白E（immunoglobulin E,IgE）水平;采用酶免疫荧光法检测血清变应原特异IgE.结果 （1）哮喘组和对照组均存在-1486位点T→C突变,哮喘组TT、TC和CC 3种基因型的频率分别是3 8.8%、48.4%和12.8%,对照组分别是41.0%、44.3%和14.7%;未发现-1237位点存在多态性.（2）哮喘组和对照组-1486位点各基因型的频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）,年龄分层后比较差异也无统计学意义（P＞0.05）.（3）哮喘组-1486位点3种基因型的血清IFN-γ和IL-4水平差异有统计学意义（P＜0.01）,CC基因型的IFN-γ水平较低而IL-4水平较高;对照组2种细胞因子的差异无统计学意义（P＞0.05）.哮喘组和对照组血清IL-12水平在3种基因型间差异均无统计学意义（P＞0.05）.（4）哮喘组-1486位点不同基因型血清总IgE水平差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 浙江汉族儿童不存在TLR9基因-1237位点多态性.TLR9基因-1486 C/T位点单核苷酸多态性与浙江汉族儿童哮喘易感性、血清IL-12及总IgE水平无关;-1486 C/T位点多态性与哮喘患儿血清IFN-γ和IL-4水平有关联,CC基因型的IFN-γ水平较低而IL-4水平较高.

脂多糖对家蚕幼虫Toll样受体基因BmToll9-2表达的影响

【目的】Toll样受体是昆虫Toll信号传导途径的一个重要组成成员,对激活昆虫机体对入侵病原微生物的先天免疫应答起着至关重要的作用。本研究旨在探究脂多糖对家蚕Bombyx mori幼虫中Toll样受体基因BmToll9-2基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR分析BmToll9-2基因在家蚕大造品系4龄和5龄幼虫表皮、脂肪体、马氏管、中肠、神经、丝腺、胸部肌肉共7种组织中的表达特征;将脂多糖和大肠杆菌Escherichia coli注射到5龄幼虫体腔内,诱导其免疫系统响应,采用实时荧光定量PCR分析注射后不同时间BmToll9-2基因在中肠中的表达水平。【结果】RT-PCR结果表明,BmToll9-2基因在家蚕4龄幼虫的脂肪体、马氏管、神经和丝腺中高度表达,在5龄幼虫脂肪体、中肠、马氏管和神经中均有较高表达。实时荧光定量PCR结果显示,注射脂多糖能诱导5龄幼虫中肠中BmToll9-2基因转录,在注射后6 h时的诱导效果最好;注射大肠杆菌也能诱导BmToll9-2基因转录,在注射后3和6 h时的诱导效果最好。【结论】家蚕幼虫BmToll9-2基因在脂多糖和大肠杆菌处理后上调表达,提示BmToll9-2受体可能参与昆虫Toll样受体对脂多糖和细菌的识别过程。

Toll样受体9基因多态性与儿童EB病毒感染关系的探讨

目的通过检测Toll样受体9(TLR9)基因rs187084、rs5743836、rs352139、rs352140 4个单核苷酸多态性(SNP)位点基因型分析其SNP与儿童EBV感染的相关性。方法收集2013年2月至2014年2月吉林大学第一医院无EBV感染及EBV感染后不同临床表现类型的患者临床资料及外周静脉血标本,其中EBV感染阴性者54例,传染性单核细胞增多症(IM)患者56例,轻微临床症状型EBV活动性感染患者69例。应用盐析法提取血标本DNA,PCR扩增包含所选SNP位点的目的 DNA片段,PCR产物直接测序,分析SNP位点基因型,比较不同组别间基因型及等位基因分布状况。结果 (1)在实验人群中,位点rs187084基因型有TT、TC、CC 3种,rs352139基因型有AA、AG、GG 3种,rs352140基因型有GG、GA、AA 3种,最小等位基因频率分别为39.7%,38.8%,41.9%。以上3位点在实验人群中具有多态性,且与相关数据库中公布的其在中国人群中分布状况相似。而位点rs5743836基因型有TT、TC 2种,TC基因型在所有样本中仅发现1例,表明此位点在实验人群中不存在多态性。(2)在研究组间,各位点基因型及等位基因频率组间分布差异无统计学意义(P均>0.05)。结论在纳入研究的179例人群中,TLR9基因位点rs5743836不存在多态性,rs187084、rs352139、rs3521403个位点存在多态性,且分布情况与相关数据库中类似,未发现此3位点的基因多态性与儿童EBV感染及疾病的严重程度有相关性。

牦牛Toll样受体8和9基因克隆及组织表达分析

为了解牦牛Toll样受体8(TLR8)和9(TLR9)蛋白的结构特征及其基因的组织表达规律,丰富牦牛TLRs基因研究的理论数据,应用RT-PCR方法克隆牦牛TLR8、TLR9基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术构建组织表达谱。结果显示,两个基因cDNA全长分别为3 102bp和3 090bp。牦牛TLR8和TLR9基因与野牦牛、黄牛和绵羊之间的同源性都很高,均在95%以上。牦牛TLR8和TLR9蛋白都具有胞外LRRs功能域、胞内区TIR结构域、低复杂度区;另外,TLR8还具有1个C端富集亮氨酸重复序列(LRRCT)和跨膜结构域。两个基因在10个组织中均有不同程度的表达,在肾脏中表达量最高,而在大肠中表达量最低。本研究成功克隆了牦牛TLR8和TLR9基因的完整编码区,并揭示了它们在各组织器官的表达规律,为进一步研究TLRs在牦牛体内的免疫机制奠定了基础。

梅花鹿天然Toll样受体9基因克隆与序列分析

Trizol法提取梅花鹿肝脏总RNA,采用ORF两端兼并引物,RT-PCR方法克隆梅花鹿天然Toll样受体9基因(TLR9)并进行系统的生物信息学分析。RT-PCR结果显示,梅花鹿TLR9基因的mRNA长4 043bp,含有800bp左右的5’UTR,完整ORF编码1 081个氨基酸(GenBank序列号为:HQ260632)。同源性分析显示梅花鹿TLR9基因编码区与其他物种高度同源,但5’UTR区存在基因结构的变异。功能结构域分析显示不同物种间TLR9结构域相对保守但也存在细微差别,结构域的差别导致梅花鹿TLR9蛋白胞外区马蹄形弧顶内侧空间结构由人类TLR9蛋白的弧形改变为梅花鹿TLR9蛋白的三角形。进化分析显示TLR9基因分子进化关系与物种间真实进化相一致。

Toll样受体2基因T597C多态性与中国南方汉族人群结核性脑膜炎的易感相关性

目的探讨Toll样受体2(TLR2)基因T597C单核苷酸多态性与中国南方汉族人群结核性脑膜炎的易感相关性。方法结核性脑膜炎组为2009年9月至2011年5月南方医院收治的确诊结核性脑膜炎患者9例,肺结核组为广州市胸科医院收治的肺结核患者20例,另选20例健康人作为对照组,各组均符合相应的纳入及排除标准。采用聚合酶链式反应及基因测序方法对TLR2基因T597C单核苷酸多态性与中国南方汉族人群结核性脑膜炎易感性进行相关分析。结果在结核性脑膜炎组中变异基因型(TC和CC)和597C等位基因的频率明显高于对照组,但变异基因型在对照组、肺结核组及结核性脑膜炎组间的频率分布差异无统计学意义(χ2=3.560,P=0.169),597C等位基因在各组间的频率分布差异无统计学意义(χ2=5.108,P=0.078)。结论尚不能证明TLR2基因T597C单核苷酸多态性与中国南方汉族人群结核性脑膜炎及肺结核的易感性相关。

广西壮族、汉族系统性红斑狼疮与Toll样受体9基因多态性研究

目的探讨TLR9单核苷酸多态性与广西系统性红斑狼疮（sLE）患者发病的相关性，以及其在壮族、汉两个民族间的差异。方法聚合酶链反应-限制性酶切技术、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR—RFLP）对97例广西SLE患者和202例广西健康对照者的TLR9基因多态性进行检测，分析其基因型和等位基因频率与SLE部分临床实验室指标的关联性，并比较两民族间的差异。结果TLR9rs352140CC、CT、TT基因型频率在汉族SLE组与汉族对照组中分别为42．9％、41．1％、16．1％和38．3％、55．8％、5．8％，差异有统计学意义（P〈0．05），其C、T等位基因频率差异无统计学意义（P〉0．05）。TLR9rs352140C／T基因型频率和等位基因频率在壮族SLE组与壮族健康对照组间、壮族SLE组与汉族SLE组间差异无统计学意义（均P〉0．05）。TLR9rs352140Tr基因型频率在ds-DNA阳性组比阴性组高（P〈0．05），而T等位基因频率在两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。TLR9rs352140TT基因型频率和T等位基因的频率在SLEDAI≥9组比SLEDAI〈9组高，差异有统计学意义（均P〈0．05）。TLR9rs352140TT基因型频率和T等位基因的频率在ANA阳性组与阴性组间差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论TLR9rs352140基因多态性可能与广西汉族人SLE的易感性有关，TLR9基因多态性与部分SLE指标可能具有相关性。

Toll样受体10基因rs10004195位点多态性与Hp感染以及相关疾病的关系

目的探讨Toll样受体10(TLR10)基因rs10004.195位点多态性与幽门螺杆菌(Hp)感染以及相关疾病的关系。方法收集行胃镜活检的患者652例,同时采集患者外周血标本。采用免疫胶体金法检测患者外周血中Hp抗体,DNA直接测序方法检测TLR10基因rs10004195位点基因型。结果 TLR10基因rs10004195位点AA、TT和AT基因型分别为30.98%、20.71%、48.31%;Hp抗体阳性组TT基因型频率明显高于Hp抗体阴性组(P<0.05)。Hp抗体阳性组中各疾病组与对照组基因型分布的比较,以及Hp抗体阴性组中各疾病组与对照组基因型分布的比较,差异均无统计学意义。结论 TLR10基因rs10004195位点多态性与Hp感染有易感相关性,而与Hp感染相关疾病无相关性。