泛素E3连接酶CHIP和E4B互换U-box结构域突变体的构建及泛素化活性验证

旨在构建互换U-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究U-box结构域对两种U-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP U-box替换为E4B U-box的突变体C+E,以及E4B U-box替换为CHIP U-box的突变体E+C。将突变体质粒分别与CHIP底物RCC2、E4B底物NIPSNAP1、CHIP和E4B共同底物p53、CDC37质粒共转染至HEK-293T细胞。Western Blot检测底物和CHIP、E4B及其突变体表达情况,免疫共沉淀法检测底物的泛素化水平。结果显示,成功构建了两种泛素连接酶互换U-box结构域的突变体,且两种突变体在HEK-293T细胞中均能表达。两种突变体均部分保留了泛素化各自底物的活性,C+E能够泛素化共同底物p53和CDC37。

CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达载体,以实现这些基因在真核细胞中的高效表达,为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法:从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA,以此为模板,采用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)获得CHIP全长编码基因,经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tag1中,并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box(-)。结果:钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致,瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论:成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体,为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。