20(S)-人参皂苷Rg3体外对多发性骨髓瘤U266细胞系的增殖抑制作用

目的探讨天然化合物20(S)-人参皂苷Rg3体外对多发性骨髓瘤U266细胞系的抑制作用。方法利用MTT、流式细胞仪检测20(S)-人参皂苷Rg3对细胞周期的影响及诱导凋亡作用;应用Western印迹技术检测加药后U266细胞凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果 20(S)-人参皂苷Rg3作用U266细胞系24、48 h的IC50值分别为(71.07±2.63)μmol/L、(44.06±3.98)μmol/L,在一定浓度范围内可抑制U266细胞系的增殖,并呈时间和浓度依赖性(P<0.05);可促进U266细胞系凋亡,并呈浓度依赖性(P<0.05);细胞周期检测,与对照组比较,G0/G1期百分比增多(P<0.05),同时S期百分比逐渐减少(P<0.05),而G2/M期百分比没有明显的变化(P>0.05);药物处理U266细胞系24 h后,Western印迹检测示随药物浓度的增加,procaspase-3表达轻度下降,cleaved caspase3显著表达上升(P<0.05)。结论在一定的浓度范围内,20(S)-人参皂苷Rg3可抑制U266细胞系的增殖,且能够诱导U266细胞系凋亡,呈剂量依赖性,诱导U266细胞凋亡可能是通过上调cleaved caspase-3的表达引起的;20(S)-人参皂苷Rg3还可以影响U266细胞系的G1/S期,使细胞阻滞在G1期,而对G2/M期无明显影响,可能是其抑制肿瘤的作用机制之一,使其成为潜在的治疗多发性骨髓瘤的新制剂。

异硫氰酸苯已酯诱导骨髓瘤U266细胞P16基因去甲基化

目的研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对骨髓瘤U266细胞株P16基因的去甲基化作用并探讨其作用机制。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测U266细胞经过PHI处理后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA的表达变化,用甲基化特异性聚合酶链反应检测PHI作用前后U266细胞株P16基因甲基化状态的变化。结果使用不同浓度的PHI处理U266细胞72h后,U266细胞表达DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA的水平明显降低并呈浓度依赖性。以不同浓度的PHI处理U266细胞10d后,P16基因的甲基化状态被逐渐逆转。结论 PHI可能通过抑制DNA甲基转移酶的表达水平诱导P16基因产生去甲基化,使失活的抑癌基因重新激活,诱导瘤细胞凋亡。

三氧化二砷诱导U266细胞p16基因重新表达

背景与目的:DNA甲基化调节基因表达,且与肿瘤发生相关,干扰抑癌基因甲基化可能成为防治肿瘤的新途径。细胞内砷代谢和DNA甲基化都需要S-腺苷蛋氨酸作为甲基供体。本文拟探讨三氧化二砷(arsenictrioxide,As2O3)诱导因高甲基化失活的抑癌基因p16重新表达的可能性及其机制。方法:以p16基因高甲基化失活的人骨髓瘤细胞系U266为研究对象,经不同浓度As2O3处理后,采用限制性内切酶HpaⅡ及其同裂酶MspⅠ结合PCR技术,检测基因组DNA及p16基因甲基化状态;RT-PCR技术检测p16基因和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)mRNA表达;Westernblot技术检测P16蛋白表达。结果:(1)U266细胞具有p16基因高甲基化并失表达的特点,即基因组DNA经MspⅠ酶切后电泳呈“涂抹”现象,而经HpaⅡ酶切后与未经酶切的DNA一样均呈单一条带;经MspⅠ酶切后的DNA不能经PCR扩增出p16基因产物,而HpaⅡ酶切后的DNA与未经酶切的DNA一样均能扩增出340bp的p16基因产物;RT-PCR法检测U266细胞无p16mRNA产物,Westernblot检测也未见P16蛋白带。(2)0.5～2.0μmol/LAs2O3处理后的U266细胞DNA经HpaⅡ酶切后电泳呈“涂抹”现象,也不再能扩增出p16基因产物。1.0μmol/L和2.0μmol/LAs2O3处理的U266细胞还扩增出p16基因mRNA产物;Westernblot也检测到P16蛋?

甘草次酸诱导U266细胞凋亡及对Survivin表达的影响

本研究旨在观察甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)对人骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及survivin表达的影响。用MTT法检测GA对U266细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测不同浓度GA作用于U266细胞后细胞凋亡,细胞周期的变化;扫描电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;实时定量PCR检测GA对U266细胞survivin基因表达的影响。结果表明:GA对U266细胞有增殖抑制作用,其抑制作用呈现为时间和浓度依赖性;GA可以诱导U266细胞凋亡;扫描电子显微镜下可见核仁染色质边集,凝聚成块;GA可以诱导U266细胞周期阻滞于G0/G1期,表现为G0/G1期细胞比例升高,而G2/M及S期细胞比例下降。GA可以下调U266细胞survivin基因的表达,下调作用与浓度呈正相关。结论 :CA能抑制U266细胞增殖,呈浓度和时间依赖性,诱导其凋亡,其作用机理可能与细胞周期阻滞于G0/G1期和下调survivin基因表达有关。

U266细胞在组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275诱导下凋亡观察

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人多发性骨髓瘤U266细胞的增殖和凋亡的影响.方法:台盼蓝拒染法观察MS-275对细胞活力的影响;瑞氏—姬姆萨染色观察药物对细胞形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期;West-ernBlot检测凋亡信号通路中Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活化及蛋白聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymer-ase,PARP]裂解情况.结果:MS-275呈时间和剂量依赖性抑制U266细胞增殖,阻断细胞周期于G0/G1期.MS-275作用48h的IC50为1.39μmol/L;2μmol/LMS-275作用细胞24h后,G0/G1期64.57%;36h占82.20%.瑞氏—姬姆萨染色显示细胞发生明显变化.WesternBlot检测表明MS-275作用U266细胞后,Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9被裂解活化,其底物蛋白聚ADP核糖聚合酶发生剪切,细胞发生凋亡.结论:MS-275可抑制细胞增殖,并使细胞阻滞在G0/G1期,通过激活细胞内外2条凋亡级联信号通路诱导U266细胞凋亡.

脱乙酰化酶抑制剂与去甲基化制剂联合诱导U266细胞凋亡和p16基因重新表达

背景与目的:DNA甲基化调节基因表达与组蛋白脱乙酰化的作用密切相关,针对这两大途径用药,观察对肿瘤细胞的影响是有意义的。本文探讨脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(sodiumphenylbutyrate,SPB)联合去甲基化制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理人骨髓瘤细胞系U266诱导高甲基化失活的p16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响。方法:通过透射电镜、DNA梯形条带及流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的变化;RT-PCR和Westernblot检测p16表达水平。结果:单用5-Aza-CdR(1μmol/L)或SPB(1mmol/L)及两药联合诱导的细胞凋亡率分别是15.09%,89.19%和85.18%。单用5-Aza-CdR或SPB对细胞G1期无影响,单用SPB使G2/M期细胞比例增高,联合用药发生明显的G1期阻滞,且出现亚G1期峰达50%。单用PB不能诱导U266细胞p16的表达,单用5-Aza-CdR可诱导p16重新表达,两药联合明显增强p16表达水平。结论:PB与5-Aza-CdR协同可显著诱导U266细胞p16重新表达,细胞阻滞在G1期,并使细胞凋亡发生的时相不同于单独用药组。

多发性骨髓瘤细胞系中ANGPT1/2基因的表达

目的检测ANGPT1/2基因在多发性骨髓瘤细胞系中的表达。方法应用实时荧光定量(RQ)-PCR方法检测两种多发性骨髓瘤细胞株U266和P3X63Ag653(653)中ANGPT1/2的表达。结果以人脐静脉内皮细胞为对照,ANGPT1在U266和653中的表达升高,与人脐静脉内皮细胞相比差异无统计学意义。ANGPT2在U266中表达降低,与人脐静脉内皮细胞相比差异无统计学意义;而ANGPT2在653中明显高表达,与人脐静脉内皮细胞相比差异有统计学意义。结论应用RQ-PCR检测ANGPT1/2在2株多发性骨髓瘤细胞系中表达,为下一步在体内外研究ANGPT-TIE在多发性骨髓瘤中的作用机制奠定基础。

20（S）-人参皂苷Rg3对U266细胞增殖及其自分泌血管内皮生长因子的影响

目的 探讨20（S）-人参皂苷Rg3[简称20（S）-Rg3]体外对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖及其自分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 以MM细胞系U266细胞为研究对象,利用MTT法检测不同浓度20（S）-Rg3对细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;ELISA法检测细胞培养上清VEGF水平;Westem blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3、8和9的表达.结果 20（S）-Rg3在一定浓度范围内可抑制U266细胞增殖,并呈浓度依赖性（P＜0.05）,作用24、48 h的IC50值分别为（71.07±2.63）μmol/L和（44.06±3.98）μmol/L;ELISA法检测结果显示20（S）-Rg3处理24 h细胞培养上清中VEGF的含量呈剂量依赖性减少（P＜0.05）,未加药组和加近IC50浓度（80 μmol/L）组的细胞培养上清中VEGF的含量分别为（419.93±36.76）和（314.82±27.05）pg/106细胞.流式细胞术检测显示0、20、40、80 μmol/L 20（S）-Rg3处理后U266细胞凋亡率分别为（0.51±0.05）％、（8.32±0.83）％、（10.72±1.29）％和（15.27±2.26）％,呈剂量依赖性升高（P＞0.05）;G0/G1期细胞比率分别为（49.11±1.71）％、（52.72±7.75）％、（60.29±5.76）％和（61.81±3.46）％,呈剂量依赖性增多（P＜ 0.05）;Western blot检测显示随20（S）-Rg3浓度的增加,procaspase-3、8和9表达略下降,cleaved caspase-3、8和9显著表达上升（P＜0.05）.结论 20（S）-Rg3可抑制U266细胞增殖,其机制可能是通过诱导细胞凋亡,上调cleaved cas-pase-3、8、9的表达及阻滞细胞周期进程实现的;20（S）-Rg3可抑制U266细胞分泌VEGF,潜在治疗MM的新制剂.

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人骨髓瘤U266细胞生长的影响及其可能机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）MS-275对人骨髓瘤细胞U266的凋亡抑制基因生存素（survivin）和核因子-κB（NF—κB）表达的影响。方法台盼蓝拒染法观察MS-275对细胞活力的影响；瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化；流式细胞仪分析细胞周期；Western blot检测survivin、p21、细胞周期依赖激酶4（CDK4）和NF—KB的抑制蛋白（IKB—α）等的表达，以及凋亡信号通路中caspase-3活化及蛋白聚ADP核糖聚合酶（PARP）裂解情况。结果MS-275抑制U266细胞增殖，阻断细胞周期于G0／G1期，呈时间-剂量依赖性。MS-275作用U266细胞48h的IC50为1．39μmol／L。2μmol／LMS-275作用U266细胞24h后，G0／G1期细胞所占比例为（64．57±4．09）％；作用36h后，G0／G1期细胞所占比例为（87．20±2．83）％；瑞氏-姬姆萨染色显示，U266细胞形态发生明显变化。Western blot检测表明，MS-275作用U266细胞后，survivin和CDK4表达下降，p21表达增加，IκB—α磷酸化水平受到明显抑制，caspase-3被裂解活化，其底物蛋白PARP发生剪切，细胞发生凋亡。结论MS-275可诱导人骨髓瘤细胞系U266凋亡，NF-KB信号通路阻断是凋亡发生的机制之一。

烷化溶血磷脂体外净化多发性骨髓瘤的实验研究

目的 选用 ET- 18- OCH3作为多发性骨髓瘤 (MM)体外净化的药物 ,处理 U2 6 6细胞和 MM骨髓细胞 ,研究 AL P对骨髓瘤细胞的杀伤作用和骨髓净化效果 ,为 AL P用于 MM的体外净化提供实验依据。研究包括 2个部分 :(1) ET- 18- OCH3对 U2 6 6细胞的抗肿瘤效应 方法 不同浓度 ET- 18- OCH3与 U2 6 6细胞作用一定时间 ,收集细胞 ,进行计数和集落形成实验 (CFU- U2 6 6 )观察 ET- 18- OCH3对 U 2 6 6细胞的杀伤作用 ;通过形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞技术观察ET- 18- OCH3诱导细胞凋亡现象 ;利用 RT- PCR、流式细胞技术检测 U2 6 6细胞 bcl- 2 ,c- myc m RNA水平及蛋白表达率 ,探讨 ET- 18- OCH3杀伤 U2 6 6细胞的作用机制。 结果 ET-18- OCH3对 U2 6 6细胞具有明显的细胞毒作用 ,并可抑制U2 6 6细胞集落的形成 ,这些作用呈剂量和时间的依赖性 ;形态学特征及梯状 DNA降解片段表明 ET- 18- OCH3;还可诱导U2 6 6细胞发生凋亡 ,并具有时效关系 ;流式细胞技术检测实验组细胞凋亡率为 17.5 3% ,而对照组细胞未出现凋亡现象 ;RT- PCR显示经 ET- 18- OCH3处理后 U 2 6 6细胞的 bcl- 2 ,c-myc RNA表达明显减少 ,分别减少了原来的 86 %和 72 % ;流式细胞技术检测 U 2 6 6细胞的 Bcl- 2、C- myc蛋白水平明?

多发性骨髓瘤患者DLC-1基因甲基化及三氧化二砷诱导DLC-1基因去甲基化的研究

目的探讨人多发性骨髓瘤（MM）肝癌缺失基因1（DLC-1）启动子区CpG岛甲基化情况，以及三氧化二砷（As2O3）诱导DLC-1基因的去甲基化作用。方法采用甲基特异性PCR法（MSP）定性检测2008至2012年来自福建医科大学附属协和医院血液内科的52例MM患者DIC基因甲基化状态，反转录（RT）-PCR检测MM患者和人骨髓瘤U266细胞系DLC-1基因的表达情况；采用重亚硫酸盐测序PCR（BSP）法定量检测As203作用前、后人骨髓瘤细胞株U266其DLC-1基因的甲基化状态；荧光定量PCR检测U266细胞用药前、后DLC-1基因、DNA甲基转移酶基因（DNMTl、DNMT3a、DNMT3b）mRNA的表达变化。结果MM患者DLC-1基因的甲基化比例为71.15％（37／52）。U266细胞DLC-1基因呈甲基化，DLC-1基因不表达；经0.5、1.0、2.0pμmol／L As203作用后72h U266细胞DLC-1基因甲基化率由95.38％下降至63.07％、30.00％及7.69％；荧光定量PCR检测经0.5、1.0、2.0pμmol／L As2O3作用后72hU266细胞DLC-1基因mRNA表达与未加药组相比分别为其（1.60±0.09）、（3.66±0.17）、（5.29±0.15）倍，而DNMTl、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA表达下调（均P〈0.05）。结论DLC-1基因甲基化在MM患者中较为常见，这可能为MM的诊断和治疗提供借鉴；As2O3可诱导DLC-1基因去甲基化，使DLC-1基因表达上调，恢复其活性，为MM去甲基化治疗提供新思路。