pSicoR/miR-17-5p靶向调控UNC-51样激酶1(ULK1)及其对细胞自噬的影响

目的为了探讨miR-17-5p对自噬相关基因ULK1的调控作用及其对细胞自噬的影响,为更深入研究miR-17-5p调控细胞自噬机制建立理论依据。方法构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒,包装miR-17-5p过表达慢病毒,构建ULK1及其突变体ULK1-mut的pmiR-report载体,通过双荧光素酶报告系统验证miR-17-5p对ULK1的靶向关系,利用Western blot检测ULK1与LC3B蛋白的表达量。结果成功构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒并且成功将ULK1及其突变体ULK1-mut的3′-UTR插入到pmiR-report载体中;双荧光素酶报告系统结果表明转染miR-17-5p及ULK1-3′-UTR,miR-17-5p过表达组相比对照组相对荧光强度降低1.9倍(P<0.05),说明miR-17-5p对ULK1的表达有抑制作用,而转染miR-17-5p及mut-ULK1-3′-UTR之后检测显示相对荧光强度并没有降低,说明miR-17-5p是靶向作用于ULK1,并对其进行负调控;Western blot显示miR-17-5p抑制ULK1蛋白的表达,并且抑制LC3II/I蛋白的表达。结论 miR-17-5p直接靶向作用于自噬相关基因ULK1,并且对其负调控,抑制细胞自噬的发生。

UNC-51样激酶1在食管癌组织中的表达及其意义

目的:观察食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)的表达情况,并分析其与ESCC患者临床病理特征和生存期的关系。方法:利用组织芯片技术结合免疫组化法检测94例食管癌组织以及78例相应癌旁组织中ULK1蛋白的表达。结果:食管癌组织中ULK1细胞质表达水平显著高于癌旁组织(P <0. 01),且与淋巴结转移有明显相关性(P <0. 05)。生存分析显示,ULK1低表达的ESCC患者生存率明显低于高表达者(风险比为1. 754,95%CI:1. 022～3. 010,P=0. 041)。结论:ULK1在ESCC中异常表达,并且ULK1低表达ESCC患者的生存期较差,ULK1可能是ESCC潜在的分子标志物。

激酶ULK1对急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡作用的研究

目的 探讨ULK1对急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM-C7凋亡的影响及与AMPKα/ULK1轴之间的关系。方法 通过予不同浓度ULK1激活剂LYN-1604(0、1.2、2μmol/L)、ULK1抑制剂MRT68921(0、1.2、2μmol/L)干预CEM-C7细胞24 h,流式细胞术检测各药物浓度对CEM-C7细胞株凋亡率的影响,筛选凋亡最明显的药物浓度进行后续实验,Edu及Soft agar实验检测其对CEM-C7细胞株增殖的影响,流式细胞术检测其对CEM-C7细胞株线粒体膜电位的影响,透射电镜观察其对CEM-C7细胞细胞核及线粒体超微结构变化的影响,Western blot检测激活和抑制ULK1后ULK1、p-ULK1(Ser317)、Caspase3、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax、PCNA、AMPKα、p-AMPKα(Ser172)的表达情况。结果 ULK1抑制剂及激活剂分别干预CEM-C7细胞24 h以后,与对照组相比,ULK1抑制剂可明显促进CEM-C7细胞发生凋亡,抑制CEM-C7细胞增殖,使细胞线粒体的膜电位明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);透射电镜可观察到明显的细胞凋亡现象;p-ULK1(Ser317)、p-AMPKα(Ser172)的蛋白水平表达下降,而ULK1激活剂对CEM-C7细胞株无明显影响。结论 ULK1可能通过AMPKα/ULK1轴影响其对CEM-C7细胞的凋亡功能。

胎盘ULK1表达与自噬及子痫前期的相关性研究

目的比较子痫前期与正常产妇胎盘组织中Unc-51样激酶1(ULK1)表达和自噬水平,分析胎盘ULK1表达与自噬水平及子痫前期病情的相关性。方法选择2021年3月至2023年5月于福建省立医院分娩的25例子痫前期患者作为子痫前期组,同期住院且年龄、产次与分娩方式相配对的25例正常产妇作为对照组。免疫组织化学检测两组产妇胎盘组织中自噬标志蛋白微管相关蛋白1A/1B-轻链3B(LC3B)、苄氯素1(Beclin1)、螯合体1(SQSTM1/p62)和ULK1蛋白的表达水平,实时荧光定量PCR检测胎盘组织ULK1的mRNA表达,电化学发光法检测子痫前期患者外周血可溶性类fms酪氨酸激酶-1(sFlt-1)和胎盘生长因子(PlGF),采用Pearson法分析ULK1表达与sFlt-1/PlGF比值的相关性。结果免疫组织化学检测结果显示,对照组与子痫前期组胎盘均可见LC3B、Beclin1和p62表达,经半定量分析结果显示,子痫前期组产妇胎盘组织的LC3B和Beclin1表达相对量分别为695.32±77.82、534.19±77.60,明显高于对照组的630.11±64.14和438.66±91.71,p62表达相对量为529.66±85.62,明显低于对照组的638.37±127.62,差异均有统计学意义(P<0.05);经实时荧光定量PCR检测结果显示,子痫前期组产妇胎盘组织ULK1的mRNA表达水平1.01±0.13,明显高于对照组的0.86±0.08,差异有统计学意义(P<0.01);子痫前期组外周血PlGF和sFlt-1水平分别为(114.12±21.71)pg/mL和(8274.126±3453.49)pg/mL,sFlt-1/PlGF比值平均为81.94±57.84,经Pearson相关性分析表明,子痫前期组胎盘组织ULK1的mRNA表达水平与外周血sFlt-1/PlGF比值呈正相关(r=0.701,P<0.05)。结论子痫前期患者胎盘组织ULK1的表达水平明显上升,与自噬水平一致,并与子痫前期严重程度密切相关,有望作为子痫前期防治的新靶点。

青藤碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对IL-1β诱导的关节软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨青藤碱(SN)调节单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/UNC-51样激酶1(ULK1)信号通路对白介素-1β(IL-1β)诱导的关节软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法将关节软骨细胞分为Control组(正常培养)、IL-1β组(10μg/L的IL-1β诱导12 h)、L-SN、M-SN、H-SN组(在IL-1β诱导的基础上添加25、50、100μmol/L的SN)、SN+Compound C组(在H-SN组的基础上添加10μmol/L AMPK抑制剂Compound C)。MTT法、透射电子显微镜(TEM)、流式细胞仪分别检测SN对各组关节软骨细胞增殖、自噬、凋亡的影响;ELISA试剂盒检测各组细胞中COX-2、TNF-α、MMP-3、MMP-13的表达;蛋白印迹实验(WB)检测各组细胞中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1蛋白水平。结果与Control组比较,IL-1β组关节软骨细胞的A 490值、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白水平降低,自噬空泡数、凋亡率、COX-2、TNF-α、MMP-3、MMP-13、p-mTOR/mTOR蛋白水平升高(P<0.05);与IL-1β组比较,L-SN组、M-SN组、H-SN组A 490值、自噬空泡数、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白水平升高,凋亡率、COX-2、TNF-α、MMP-3、MMP-13、p-mTOR/mTOR蛋白水平降低(P<0.05);与H-SN组比较,SN+Compound C组A 490值、自噬空泡数、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白水平降低,凋亡率、COX-2、TNF-α、MMP-3、MMP-13、p-mTOR/mTOR蛋白水平升高(P<0.05)。结论SN可以通过促进IL-1β诱导的关节软骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,其机制可能是通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路实现的。

金果胃康胶囊对胃癌前病变模型大鼠胃黏膜ULK1/AMPK/mTOR信号通路的影响

目的:探讨金果胃康胶囊对胃癌前病变(PLGC)大鼠UNC-51样激酶1(ULK1)/5’-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法:75只SPF级Wistar大鼠,除空白组外,采用MNNG复合造模法建立PLGC大鼠模型,造模成功后运用随机数字表法分为模型组、叶酸组及金果胃康高、中、低剂量组,每组12只。灌胃给药8周后取材。HE染色观察胃黏膜病理学变化,免疫组化法检测ULK1蛋白表达水平,qPCR检测胃组织AMPK、mTOR mRNA表达水平,Western blot检测胃组织AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平。结果:金果胃康胶囊可显著改善PLGC大鼠胃黏膜萎缩、肠化生、上皮结构、形态紊乱及细胞异型性等病理表现。与模型组比较,金果胃康胶囊能显著上调AMPK、p-AMPK、ULK1的表达水平,下调mTOR、p-mTOR的表达水平(P<0.05),以高剂量组疗效最为显著。结论:金果胃康胶囊可能通过调控ULK1/AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,修复胃黏膜病变,从而起到防治PLGC的作用。

大黄糖络丸通过AMPK/mTOR/ULK1通路调控糖尿病肾病小鼠足细胞自噬的作用机制研究

目的:探究大黄糖络丸(DHT)基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠的干预作用。方法:40只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组,达格列净组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)),DHT高、中、低剂量组(3.6、1.8、0.9 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组8只;另取10只C57BL/KSJ-db/dm(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,连续给药10周,1次/d。于给药0、4、8、10周固定时间,禁食不禁水12 h,取尾静脉血检测空腹血糖(FBG);于给药0、5、10周末收集尿液检测尿中白蛋白、肌酐含量,计算尿白蛋白肌酐比值(ACR);给药10周后,检测各组小鼠24 h尿总蛋白,血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)含量;蛋白免疫印迹法检测肾脏组织p-AMPK、p-mTOR及p-ULK1蛋白的表达水平,以及自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62蛋白的表达水平;免疫组化法检测肾脏组织足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin、Podocin)的表达水平;采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态学变化。结果:与模型组比较,达格列净组和DHT组小鼠FBG、ACR、24 h尿总蛋白均降低,Scr、BUN无统计学差异;肾组织中p-AMPK、p-ULK1表达水平升高,p-mTOR表达水平降低及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高,P62表达水平降低(P<0.01,P<0.05);肾小球的足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达水平升高(P<0.01,P<0.05);肾脏病理损害减轻;透射电镜显示自噬小体、自噬溶酶体数量增加。结论:DHT可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强足细胞自噬,保护肾小球,延缓DN发展进程。

鱼藤酮激活AMPK-ULK1信号通路诱导大鼠胸主动脉内皮细胞自噬

目的探讨鱼藤酮对大鼠胸主动脉内皮细胞(RTAEC)自噬的影响及其初步机制。方法选用60只雄性SD大鼠,随机分为对照(Con)组、二甲基亚砜(DMSO)组和鱼藤酮组[1、2、4 mg·(kg·d)^(-1)],各组分别干预28 d。实验前后分别记录大鼠体质量、血压和心率;HE染色观察胸主动脉和心脏组织病理生理改变,透射电镜观察其超微结构及自噬小体发生。细胞实验分组:Con组、DMSO组和鱼藤酮组(20、100和500 nmol·L^(-1)),分别处理24 h,用活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)水平筛选鱼藤酮干预最佳浓度后,选取500 nmol·L^(-1)进行后续干预。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC)在鱼藤酮处理前2 h干预细胞;RT-qPCR和Western blot检测胸主动脉自噬相关因子及腺苷酸激活的蛋白激酶-UNC-51样激酶1(AMPK-ULK1)通路的改变。结果与DMSO组相比,鱼藤酮组体质量增长量减少(P均<0.01);鱼藤酮对大鼠的血压和心率没有影响(P均>0.05);HE结果显示,鱼藤酮组胸主动脉内皮细胞伴有缺损,且心脏组织纤维排列紊乱、断裂;透射电镜结果发现,鱼藤酮组胸主动脉和心脏组织伴有结构异常及自噬小体出现;随着RTAEC鱼藤酮干预浓度增大,ROS产生水平增加(P<0.01),而ATP的生成减少(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与DMSO组相比,LC3和P62的mRNA表达水平均上调(P均<0.01);信号通路相关因子AMPK和ULK1的mRNA表达水平均增加(P均<0.01);加入AMPK抑制剂CC,Western blot检测自噬相关蛋白,与500 nmol·L^(-1)组相比,LC3表达降低(P<0.01),P62表达上调(P<0.01);AMPK和p-AMPK表达减少(P均<0.01),AMPK的下游因子ULK1及p-ULK1表达均减少(P均<0.01)。结论鱼藤酮可促进RTAEC发生自噬,而其自噬机制可能是通过AMPK-ULK1信号通路介导。

ULK1对肝癌细胞生长的调节及其抑制剂对细胞增殖的影响

目的探讨UNC-51样激酶1(ULK1)在肝细胞癌(HCC)中的表达及预后,敲减ULK1或抑制ULK1激酶的活性是否可以抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡并增强奥沙利铂的敏感性。方法在在线数据库中分析ULK1在泛癌和HCC中的表达和预后;定量实时聚合酶链反应验证不同ULK1敲减序列的敲减效率;CCK8法检测敲减ULK1对肝癌细胞系HepG2增殖能力的影响;CCK8法检测ULK1抑制剂和奥沙利铂对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术探讨奥沙利铂与ULK1抑制剂联合对HepG2细胞凋亡的影响;免疫印记法实验检测奥沙利铂与ULK1抑制剂联合对HepG2细胞自噬的影响。结果ULK1在HCC中高表达且与患者预后呈负相关;在HepG2细胞中成功敲减ULK1基因;敲低ULK1可降低HepG2细胞增殖能力;ULK1抑制剂和奥沙利铂联合可抑制HepG2细胞增殖,同时增加HepG2细胞凋亡数量;其机制可能与增强HepG2细胞自噬有关。结论敲低ULK1或使用ULK1抑制剂,可抑制HepG2细胞增殖并诱导凋亡,或有可能增强化疗药物毒性作用,其机制可能与细胞自噬的调控有关。

橙皮素抑制TLR4-mTOR-ULK1信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨橙皮素(HES)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠细胞自噬与凋亡的影响,并初步分析其机制。方法 将SD大鼠分为假手术(Sham)组、MIRI组、低剂量HES(HES-L,15 mg/kg)组、高剂量HES(HES-H,30 mg/kg)组和HES-H+Toll样受体4(TLR4)抑制剂(HES 30 mg/kg+复合物C 0.2 mg/kg)组。连续给药7 d,除Sham组外,大鼠采用冠脉结扎法构建MIRI模型,24 h后检测左心室血流动力学参数[包括左室舒张期末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)];采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测心肌梗死(心梗)面积,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);Western blotting检测大鼠心肌组织中微管相关蛋白1-轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、自噬效应蛋白(Beclin1)、TLR4、磷酸化(p)-TLR4、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、p-ULK1蛋白表达。结果 与Sham组比较,MIRI组大鼠心肌细胞线粒体损伤、自噬空泡形成;LVEDP[mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa):14.22±2.12比5.44±0.83]、心肌细胞凋亡率[(31.52±4.01)%比(2.41±0.26)%]、心梗面积(mm2:43.68±3.86比0.00)、心肌组织MDA(ng/L:8.25±1.03比3.71±0.65)、p-mTOR/mTOR(0.76±0.08比0.33±0.04)、p-ULK1/ULK1(0.69±0.08比0.22±0.03)均显著升高,dp/dtmax(mmHg/s:3 441.43±289.25比4 910.57±350.12)、-dp/dtmax(mmHg/s:2 588.96±260.23比3 845.94±364.19)、心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.13±0.14比2.35±0.21)、Beclin1(0.35±0.06比0.87±0.09)、p-TLR4/TLR4(0.40±0.05比0.84±0.10)均显著降低(均P <0.05)。与MIRI组比较,HES-L、HES-H组大鼠线粒体损伤缓解,自噬空泡少见;LVEDP(mmHg:11.56±1.60、7.88±1.21比14.22±2.12)、心肌细胞凋亡率[(25.52±3.11)%(、17.54±1.89)%比(31.52±4.01)%]、心梗面积(mm2:36.67±3.58、29.58±3.04比43.68±3.86)、心肌组织MDA(ng/L:6.98±0.65、4.12±0.48比8.25±1.03)、p-m TOR/m TOR(0.60±0.07、0.45±0.05比0.76±0.08)、p-ULK1/ULK1(0.54±0.05、0.32±0.04比0.69±0.08)均显著降低,dp/dtmax(mmHg/s:3 972.82±310.17、4 442.97±396.24比3 441.43±289.25)、-dp/dtmax(mmHg/s:3 152.30±312.18、3 430.57±324.24比2 588.96±260.23)、心肌组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.76±0.18、2.01±0.20比1.13±0.14)、Beclin1(0.56±0.07、0.79±0.08比0.35±0.06)、p-TLR4/TLR4(0.55±0.06、0.73±0.08比0.40±0.05)均显著升高(均P <0.05)。结论 HES可通过抑制TLR4-m TOR-ULK1信号通路促进MIRI大鼠心肌细胞自噬,抑制凋亡。

IGF-1介导TDAG51对抑郁模型大鼠海马PI3K/Akt/FoxO3a信号通路的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导T细胞死亡相关蛋白51(TDAG51)对抑郁模型大鼠海马磷脂酰肌苷3激酶/蛋白激酶B/叉头状转录因子O亚族3a(PI3K/Akt/FoxO3a)信号通路的影响。方法:将50只大鼠按分层随机法分为空白对照组、CUMS组、CUMS+IGF-1组、CUMS+LV-TDAG51-shRNA组、CUMS+IGF-1+LV-TDAG51-shRNA组,每组10只。慢性不可预测轻度应激(CUMS)诱导产生抑郁症大鼠模型。CUMS+IGF-1组大鼠注射5 mL IGF-1(5 mg/mL)和300μL LV-NC慢病毒;CUMS+LV-TDAG51-shRNA组大鼠注射5 mL生理盐水和300μL LV-TDAG51-shRNA慢病毒;CUMS+IGF-1+LVTDAG51-shRNA组大鼠注射5 mL IGF-1(5 mg/mL)和LV-TDAG51-shRNA慢病毒。空白对照组及CUMS组大鼠注射5 mL生理盐水和300μL LV-NC慢病毒。检测大鼠体重和蔗糖消耗量的变化;旷场实验检测大鼠自主行为;实时荧光定量PCR检测大鼠海马TDAG51、PI3K/Akt/FoxO3a信号通路相关因子的mRNA表达;Western blot检测TDAG51蛋白表达及PI3K/Akt/FoxO3a信号通路相关因子的磷酸化水平。结果:与空白对照组相比,CUMS组大鼠体重、蔗糖消耗量、水平交叉数、垂直时间和PI3K、Akt、FoxO3amRNA表达及磷酸化水平显著降低(P<0.05);与CUMS组相比,CUMS+IGF-1组和CUMS+IGF-1+LVTDAG51-shRNA组大鼠海马TDAG51 mRNA和蛋白表达、PI3K、Akt、FoxO3a mRNA表达和磷酸化水平显著升高(P<0.05),体重、蔗糖消耗量、水平交叉数和垂直时间显著升高(P<0.05),CUMS+LV-TDAG51-shRNA组则低于CUMS组;与CUMS+IGF-1组相比,CUMS+IGF-1+LV-TDAG51-shRNA组大鼠海马TDAG51 mRNA和蛋白表达、PI3K、Akt、FoxO3a mRNA表达和磷酸化水平显著降低(P<0.05),体重、蔗糖消耗量、水平交叉数和垂直时间显著降低(P<0.05)。结论:IGF-1可能通过介导TDAG51活化抑郁症模型大鼠海马PI3K/Akt/FoxO3a信号通路,改善抑郁症症状。

白桦脂酸调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的探究白桦脂酸通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响。方法原代培养冠心病大鼠血管平滑肌细胞,将其随机分为正常组(Control组)、模型组(Model组)、低浓度(20μmol/L)白桦脂酸组(BA-L组)、高浓度(40μmol/L)白桦脂酸组(BA-H组)和高浓度(40μmol/L)白桦脂酸+AMPK抑制剂(10μmol/L)Compound C组(BA-H+CC组)。CCK-8法检测大鼠血管平滑肌细胞的细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡。mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪大鼠血管平滑肌细胞的自噬小体。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表达。Western blot实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平。结果与Control组相比,Model组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。与Model组相比,BA-H组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05)。Compound C减弱了白桦脂酸对血管平滑肌细胞自噬和凋亡的促进作用(P<0.05)。结论白桦脂酸可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进冠心病大鼠血管平滑肌细胞的自噬和凋亡。

细胞自噬与ULK1蛋白关系的研究进展

细胞自噬是生物体重要的代谢过程,在各个生理、病理过程中扮演重要角色。它由自噬相关蛋白控制,受多条信号通路调控。细胞自噬在神经退行性病变、肿瘤发生、缺血/再灌注损伤、糖尿病、循环系统疾病等方面有重要作用,其可以清除细胞内受损的物质或细胞器,为细胞提供原料和良好的细胞环境。而在细胞自噬的形成过程中,unc-51样激酶1(ULK1)蛋白发挥重要作用,它是细胞自噬的起始开关。因此,通过对ULK1蛋白上下游信号的深入研究,以ULK1蛋白为治疗靶点,干预和调控细胞自噬,将为疾病的治疗提供新的方向。

黄芪甲苷通过调控AMPK/ULK1信号通路减轻高糖诱导的大鼠H9c2细胞损伤

目的:探讨黄芪甲苷(Astragaloside IV,ASIV)对高糖(high glucose,HG)环境下大鼠心肌H9c2细胞系自噬水平的调控作用及相关机制。方法:高浓度(33.3 mmol/L)葡萄糖对H9c2细胞进行干预,建立HG体外损伤模型。将细胞分为低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)对照(control)组、HG组、HG+ASIV(100μmol/L)组和HG+ASIV(100μmol/L)+Compound C(5μmol/L)组。CCK-8法检测H9c2细胞活力;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞损伤;Western blot检测微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-I、LC3-II、beclin-1、p62及AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/Unc-51样激酶1(Unc-51-like kinase 1,ULK1)信号通路相关蛋白的表达变化;免疫荧光法检测LC3B表达。结果:100μmol/L ASIV可显著抑制HG诱导的心肌细胞活力下降(P<0.05),减少HG条件下LDH释放(P<0.05);ASIV可显著逆转HG诱导的心肌细胞LC3-II/LC3-I比值、beclin-1蛋白表达水平及AMPK和ULK1磷酸化水平的下降,以及p62蛋白的高表达(P<0.05),使HG条件下受到抑制的LC3B荧光强度增加。ASIV促进自噬以及增加AMPK和ULK1磷酸化的作用可被AMPK抑制剂Compound C阻断。结论:ASIV可能通过调节AMPK/ULK1信号通路提高大鼠心肌H9c2细胞自噬水平,从而减轻心肌细胞的HG损伤。

自噬启动因子ULK1的生物学功能与靶向治疗研究进展

UNC-51样激酶1(ULK1)作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶是哺乳动物中的自噬启动因子,也是酵母中Atg1的同源蛋白.近年来,大量研究揭示了ULK1的结构特征及其生物学功能,并阐明了其调控自噬的途径及其与多种疾病的关系.最新研究还发现了一系列直接或间接靶向ULK1调节自噬的小分子化合物,为开发靶向自噬的新候选药物提供了线索.该文综述了ULK1作为自噬启动因子的复杂生物学功能、与多种疾病的关系及其潜在的靶向治疗应用.

NEDD4L和ULK1在非小细胞肺癌中的表达及预后价值

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中NEDD4样E3泛素蛋白连接酶(NEDD4L)、UNC-51样激酶1(ULK1)的表达及临床意义。方法选取2017年1月—2018年1月三二〇一医院收治的88例NSCLC患者作为研究对象。应用R语言分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中NSCLC及癌旁组织中NEDD4L和ULK1 mRNA的表达差异,免疫组织化学法分析癌组织和癌旁组织中NEDD4L和ULK1蛋白的表达,Kaplan-Meier法分析NEDD4L、ULK1表达与患者生存预后的关系,单因素及多因素Cox回归分析影响NSCLC患者生存预后的危险因素。结果癌组织NEDD4L mRNA相对表达量低于癌旁组织(P<0.05),ULK1 mRNA相对表达量高于癌旁组织(P<0.05)。癌组织NEDD4L的阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05),ULK1的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。有无淋巴结转移、不同TNM分期患者的癌组织NEDD4L、ULK1阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,NSCLC患者癌组织中NEDD4L与ULK1的表达呈负相关(r_(s)=-0.587,P<0.05)。NEDD4L阴性表达患者3年总体生存率较阳性表达患者低(P<0.05),NEDD4L阳性表达患者平均生存时间较阴性表达患者长(P<0.05)。ULK1阳性表达患者3年总体生存率较阴性表达患者低(P<0.05),LK1阳性表达患者平均生存时间较阴性表达患者长(P<0.05)。单因素Cox回归分析结果显示,肿瘤TNM分期Ⅲ期[HR^(^)=1.898(95%CI:1.320,2.729)]、NEDD4L阴性表达[HR^(^)=1.654(95%CI:0.921,2.588)]和ULK1阳性表达[HR^(^)=1.692(95%CI:0.860,2.650)]是NSCLC患者预后的影响因素(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,NEDD4L阴性表达[HR^(^)=1.878(95%CI:0.961,2.995)]、ULK1阳性表达[HR^(^)=1.679(95%CI:0.785,2.884)]及肿瘤TNM分期Ⅲ期[HR^(^)=1.937(95%CI:1.131,3.317)]是NSCLC患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论NSCLC中NEDD4L表达降低,ULK1表达升高,NEDD4L、ULK1的表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关,NEDD4L阴性表达、ULK1阳性表达是NSCLC患者不良预后的独立危险因素。

ULK1启动子区含有抑制ULK1转录的G4结构

目的:研究G四联体(G-quadruplex,G4)结构对UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)基因的转录调控作用。方法:分析ULK1转录起始点上游1000 bp启动子序列的G/C含量;预测ULK1启动子区G4形成序列,利用圆二色谱、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染鉴定G4;通过构建ULK1启动子报告基因质粒和用G4配体处理人前列腺癌DU-145细胞,结合报告基因检测、RT-qPCR和Western blot实验检测G4对ULK1转录的调控作用。结果:ULK1启动子区G/C含量丰富;预测发现10条G4形成序列;体外实验表明G4形成序列可以形成G4结构;细胞实验表明ULK1启动子区的G4结构负调控ULK1的转录。结论:ULK1启动子区可形成抑制ULK1转录的G4结构。这为揭示ULK1的转录调控机制提供了新的线索。

lncRNA-NORAD表达对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响及其机制

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA)-DNA损伤诱导的非编码RNA(NORAD)在食管癌Eca-109细胞中的表达,分析沉默NORAD通过miR-26a-5p/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响。方法:收集45例食管癌患者癌组织和40例癌旁正常组织标本,培养正常人食管鳞状上皮Het-1A细胞和食管癌Eca-109细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测癌组织、癌旁正常组织、Het-1A细胞和Eca-109细胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA表达水平。采用miRanda数据库检测NORAD与miR-26a-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测NORAD与miR-26a-5p的关系。根据实验目的和转染质粒的不同,Eca-109细胞分为siRNA NC组和NORAD siRNA组,inhibitor NC组和miR-26a-5p inhibitor组,pcDNA-3.1(+)+mimics NC组、pcDNA-NORAD+mimics NC组、pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平。采用TargetScan数据库检测miR-26a-5p与ULK1的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测miR-26a-5p与ULK1的关系。Eca-109细胞分为siRNA NC组和ULK1 siRNA组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。Eca-109细胞分为siRNA NC+inhibitor NC组、NORAD siRNA+inhibitor NC组、siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组,采用RT-qPCR和Western blotting法检测各组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平。结果:与癌旁组织或Het-1A细胞比较,食管癌组织或Eca-109细胞中NORAD和ULK1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),miR-26a-5p表达水平明显降低(P<0.01)。与siRNA NC组比较,NORAD siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。miRcode数据库和双荧光素酶报告基因检测,NORAD靶向miR-26a-5p。与inhibitor NC组比较,miR-26a-5p inhibitor组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组比较,pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。TargetScan数据库和双荧光素酶报告基因检测,miR-26a-5p靶向ULK1。与siRNA NC组比较,ULK1 siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组比较,NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:沉默lncRNA-NORAD可抑制Eca-109细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化(EMT),其机制可能是通过调控miR-26a-5p/ULK1轴实现的。

基于AMPK/ULK1介导的自噬探讨牡荆素对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制

目的探究牡荆素对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其可能的调控机制。方法将BALB/c裸鼠通过左侧前肢腋窝下接种CNE-2细胞构建鼻咽癌裸鼠成瘤模型,待模型构建成功后随机分为模型组、牡荆素组(5、10 mg/kg)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂组(AICAR,200 mg/kg)、牡荆素+AMPK抑制剂组(Compound C,20 mg/kg),每组各10只。牡荆素组分别按照相应剂量ig;AICAR组ip 200 mg/kg AICAR;牡荆素+Compound C组采取ig 10 mg/kg牡荆素的同时ip 20 mg/kg Compound C,以上各组连续给药21 d。给药结束后测定裸鼠移植瘤体积和质量;苏木素–伊红(HE)染色观察移植瘤组织病理学改变;TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡情况;免疫组织化学检测肿瘤组织微管相关蛋白轻链3(LC3)-II、泛素结合蛋白(p62)蛋白表达;免疫荧光检测肿瘤组织LC3-II和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达;Western blotting检测肿瘤组织Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Casapse-3蛋白及AMPK/UNC-51样激酶1(ULK1)通路相关蛋白相对表达。结果与模型组相比,牡荆素各剂量组、AICAR组肿瘤生长缓慢,肿瘤体积和质量均显著降低(P<0.05);肿瘤细胞凋亡率,Caspase-3、LC3-II、Bax/Bcl-2、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达均显著升高,p62蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与牡荆素10 mg/kg组相比,牡荆素+Compound C组肿瘤生长良好,肿瘤体积和质量均增加(P<0.05),肿瘤细胞凋亡率,Caspase-3、LC3-II、Bax/Bcl-2、p-AMPK/AMPK、P-ULK1/ULK1蛋白表达均显著降低,p62蛋白表达均显著升高(P<0.05)。结论牡荆素能够抑制鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长,其机制与激活AMPK/ULK1通路介导的自噬,促进肿瘤细胞凋亡相关。

大黄-黄连调控AMPK/ULK1/Beclin1通路改善db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗的机制

目的:探讨大黄-黄连通过调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/UNC-51样激酶1(ULK1)/自噬关键分子苄氯素1(Beclin1)通路减轻db/db小鼠胰岛素抵抗的作用及其机制。方法:采用db/db小鼠,雄性6周龄db/db小鼠60只,随机分为模型组、二甲双胍组(0.26 g·kg^(-1))、大黄-黄连低、中、高剂量组(2.25、4.5、9 g·kg^(-1));将同周龄db/m小鼠作为空白组,每组12只。连续灌胃给药干预8周,空白组和模型组每日给予等量蒸馏水灌胃,1次/d,观察小鼠生存状态并使用罗氏血糖设备检测空腹血糖(FBG);采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠空腹血清胰岛素(FINS)并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);采用苏木素-伊红(HE)染色法观察小鼠肝脏病理变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏组织中AMPK、Beclin1、自噬相关蛋白5(Atg5)及p62蛋白表达水平;免疫荧光检测肝脏组织中自噬相关蛋白1轻链3B(LC3B)、ULK1的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测AMPK、Beclin1、Atg5、ULK1、p62 mRNA表达水平。结果:与空白组比较,模型组体质量显著升高(P<0.01);FBG、FINS、HOMA-IR水平均有所改变(P<0.01);肝细胞结构紊乱;肝脏组织中AMPK、Beclin1、Atg5蛋白表达水平显著降低(P<0.01);p62蛋白表达水平显著升高(P<0.01);mRNA与蛋白表达水平基本一致。与模型组比较,二甲双胍组、大黄-黄连高、中剂量组体质量明显降低(P<0.05);FBG、FINS、HOMA-IR均有所下降(P<0.05,P<0.01);治疗后各组小鼠的肝脏结构损伤均有不同程度减轻;肝脏组织中AMPK、Beclin1、Atg5、LC3B和ULK1蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),p62蛋白表达下降(P<0.01);且mRNA与蛋白表达水平大致相同。结论:大黄-黄连可以有效改善肝脏胰岛素抵抗,调控AMPK自噬信号通路,减轻db/db小鼠胰岛素抵抗从而有效防治2型糖尿病的发生发展。