人绒毛膜癌JAR/VP16多药耐药细胞株的建立及相关基因表达检测

目的:建立人绒毛膜癌鬼臼乙叉甙(VP16)耐药细胞株,检测其生物学特性及耐药和凋亡相关基因的表达,探讨多药耐药性产生与凋亡基因改变之间的相关性。方法:体外采用VP16浓度梯度递增法诱导建立JAR/VP16耐药细胞株,终浓度药物维持培养4个月,MTT法测定多药耐药谱及耐药稳定性;倒置相差显微镜观察并结合HE染色探讨耐药细胞在光镜下的形态学变化,电镜观察细胞的超微结构;基因芯片检测耐药相关基因及凋亡相关基因的表达。结果:①历经14个月、70多代耐药诱导培养,成功构建人绒毛膜癌JAR细胞耐VP16的耐药细胞株,命名为J“AR/VP16耐药细胞株,”与JAR细胞相比有显著的形态学改变,其对VP16的耐药性能稳定,耐药指数(RI)为73.67;并且对紫杉醇(TAX)、甲氨蝶呤(MTX)和更生霉素(KSM)具有显著的交叉耐药性,耐药指数分别为26.18、18.67和14.73;对5-氟尿嘧啶(5-FU)和长春新碱(VCR)的耐受性有所增加(RI∶2.88;3.45);对阿霉素(ADM)则无明显的交叉耐药(RI∶1.39)。②基因芯片结果表明,JAR/VP16细胞MRP1、MRP2、MRP6、BCRP、LRP和Rb等耐药基因表达明显高于亲本细胞,并且Bcl-2、Bcl-x、MyD88、TRAF-4、TRAF-6、Trip等凋亡抑制基因表达上调,Bax、BimL、Blk、Caspase-7-、8、-13-、14以及Fas和FasL等凋亡促进基因表达下调。结论:①JAR/VP16细胞呈现多药耐药性且耐药性能稳定,为研究耐药机制及筛选药物提供了理想的实验模型。②JAR/VP16细胞中凋亡相关基因表达的改变可能是其产生多药耐药性的一个重要机制。

转pti5-vp16基因小麦的分子检测和抗病性鉴定

将携带pti5 vp16基因的pJZ170质粒附着微弹用基因枪轰入辽春 10号、铁春 1号和丰强 3号小麦幼胚 ,2d后检测瞬时表达 ,GUS染色 ,幼胚表面有明显的蓝点 ,单个幼胚蓝点数多达 85个 ;对经ppt2次筛选后的转基因小麦植株进行PCR检测 ,检出 6株阳性植株 ;对部分PCR检测呈阳性的植株进行斑点杂交和Southern印迹杂交检测 ,转基因植株均产生杂交信号。对PCR呈阳性的转基因小麦植株接种小麦白粉病菌 ,接种 7d后 ,病害表型多数为抗病 ;接种 14d后 ,病害表型为抗病、中抗及中感 ,病害严重度明显轻于对照。

氟维司群联合VP16治疗多线后晚期乳腺癌1例

1 病例资料 患者，女性，49岁。2000年5月行右乳腺癌根治术，术后病理显示为（右乳）浸润性导管癌，肿块直径3cm，腋下淋巴结11枚，3枚见癌浸润，ER（＋）、PR（-）、HER．2、Ki．67不详。术后CEF方案化疗6个周期后序贯三苯氧胺（tamoxifen，TAM）治疗5年。2006年6月发现锁骨上淋巴结转移，行局部放疗联合多西他赛化疗，

BCL—2蛋白不能抑制VP16诱导的乳腺癌细胞(Bcap37)凋亡

目的 为了解BCL—2在Bcap37细胞表达增高能否抑制足叶乙甙诱导的细胞凋亡,把重组的逆转录表达载体pLXSN—bcl—2和pLXSN—neo转染Bcap37细胞,经G418筛选获得表达细胞(Bcap37—bcl—2,Bcap37—neo)。方法 经RT—PCR和Western blotting检测bcl—2基因的表达,并用不同浓度的VP16处理两种细胞16小时,经细胞形态观察、细胞凋亡原位显示、MTT实验检测细胞的凋亡变化。结果 两种细胞的凋亡变化没有显著差异。结论 BCL—2高表达不能阻滞VP16诱导的Bcap37细胞凋亡,这与我们以前所做的关于BCL—2能阻滞VP16诱导的K562细胞凋亡作用相反,推测BCL—2的抗凋亡作用可能和细胞类型有关,可能还有其它因素参与BCL—2对细胞凋亡的调节。

TNF-α/Vp16系统对胶质瘤基因治疗的实验研究

目的在体外水平（invitro）建立对胶质瘤有杀伤作用的TNF－α基因／Vp16系统，研究该系统的有效性及可行性。方法用逆转录病毒载体将TNF－α基因转染人胶质瘤细胞株SHG－44，经生长抑制试验，比较转TNF－α基因前后SHG－44细胞对Vp16的敏感性。结果生长抑制试验表明，转染TNF－α基因后的SHG－44细胞对Vp16的敏感性是转基因前细胞的10倍（P＜0．01），IC50为0．8μg／ml；TNF－α基因／Vp16系统对胶质瘤的杀伤作用优于TNF－α细胞因子与Vp16的联合应用（P＜0．05），并具有良好的旁观者效应。结论在invitro水平，转TNF－α基因SHG-44细胞对Vp16的敏感性大大增加，小剂量Vp16即可达到杀伤肿瘤细胞的作用，表明TNF－α基因/Vp16系统可成为细胞因子基因联合化学药物治疗胶质瘤的有效方法。

5-FU持续48h静脉滴注联合大剂量醛氢叶酸加VP16方案治疗晚期胃癌的临床观察

目的 :评价 5 FU持续 48h静脉滴注联合大剂量醛氢叶酸加VP16(足叶乙甙 ) (ELF方案 )治疗晚期胃癌的疗效及毒副作用。方法 :对入选的 2 5例晚期胃癌采用 5 FU持续 48h静脉滴注联合大剂量醛氢叶酸加VP16方案进行治疗。结果 :CR 2例 ,PR 11例 ,NC 5例 ,PD 7例 ,有效率 (CR +PR)为 5 2 % (13 /2 5 ) ,主要不良反应为恶心、呕吐、骨髓抑制、口腔黏膜反应以及外周静脉炎 ,除外周静脉炎较严重外 ,多数为Ⅰ～Ⅱ度 ,病人耐受良好。结论 :5 FU持续 48h静脉滴注联合大剂量醛氢叶酸加VP16(ELF方案 )治疗晚期胃癌的疗效较好 ,中心静脉置管或外周静脉插管可明显减少静脉炎的发生。

VP16损害大鼠卵巢组织结构和内分泌功能的实验研究

目的:探讨抗肿瘤药依托泊苷(VP16)对大鼠卵巢组织结构和内分泌功能的影响。方法:选用40只3～4月龄雌性SD大鼠,随机将其分为空白对照组,VP16低、中、高剂量组。用药后比较4组大鼠卵巢、子宫湿重和卵巢组织结构的变化,采用放射免疫方法测定4组大鼠促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)水平,并用免疫组织化学方法观察VP16不同剂量组对半胱天冬酶-3(caspases-3)在卵巢颗粒细胞中表达的影响。结果:与空白对照组相比:光镜下可见VP16高,中剂量组对卵巢组织破坏程度较大,卵泡教明显减少,且血清FSH升高,E2下降,caspases-3蛋白均强表达,差异有统计学意义;VP16低剂量组对卵巢组织破坏程度较小,卵泡数有所减少,且FSH升高、E2下降不显著,caspases-3蛋白呈弱表达,差异无统计学意义。结论:VP16对大鼠卵巢的损害程度与药物剂量成正相关,对卵巢组织的损伤可能与caspases-3凋亡途径有关。

三种小干扰RNA干扰VP16 mRNA对单纯疱疹病毒-1复制的影响研究

目的探讨体外合成小干扰RNA(siRNA),在RNA干扰(RNAi)技术条件下,单纯疱疹病毒-1(HSV-1)感染Vero细胞过程中,病毒间层蛋白VP16的生物学功能。方法用T7RNA聚合酶体外合成针对VP16mRNA的三种siRNA。用脂质体2000转染Vero细胞后接种HSV-1,感染后不同时相点(12,24,36,48,60,72hpi)分别采取实验组(R)和对照组(C)标本,检测病毒滴度值,绘制子代病毒一步生长曲线。用同位素标记新合成的VP16进行免疫沉淀法检测病毒蛋白表达的变化。结果病毒子代一步生长曲线显示,转染siRNA的实验组Vero细胞接种HSV-1后24h(24hpi),病毒滴度明显低于对照组;12hpi也观察到病毒滴度低于对照组的现象;多位点的siRNA具有协同作用;实验组病毒滴度高峰出现时间后移大约12h。siRNA影响了病毒的蛋白表达。结论T7RNA聚合酶体外合成的siRNA可以用于RNAi技术研究;HSV-1间层蛋白VP16对病毒复制和组装、成熟起重要的生物学作用。

VP16/三元LDH复合材料的制备表征及性质

依托泊苷(VP16)是一种广谱性抗癌药物。分别采用共沉淀和离子交换法制备了VP16/三元LDH纳米载药复合材料,以提高药物的抗肿瘤性能,降低药物的生物毒性。研究结果显示,VP16/三元层状氢氧化物纳米复合载药体系呈片层结构,所得纳米粒分布均匀,其中由共沉淀法和离子交换法(即经氨基酸预插层)制备的谷胱甘肽/层状双氢氧化物纳米复合体系的载药量分别为13.69%和20.36%,具有良好的缓释性能。细胞毒性实验结果证明了以三元层状氢氧化物材料作为依托泊苷载体,可降低依托泊苷的细胞毒性,且纳米载药复合体系对肿瘤细胞活性抑制率达60%,远大于药物本身的抑制率32%。结果表明LDH纳米材料作为药物分子VP16的载体,能在提高肿瘤抑制效果的同时降低一定的正常细胞毒性作用,并且实现药物的定量控释传递,可作为一种新型的抗肿瘤复合片剂。

Cy-VP16-fTBI预处理的干细胞移植治疗恶性血液病的长期疗效

目的Cy-VP16-fTBI预处理方案的造血干细胞移植治疗血液系统恶性疾病的长期疗效观察。方法造血干细胞移植治疗16例恶性血液病患者，其中异基因外周血干细胞移植8例，异基因骨髓移植5例，自体外周血干细胞移植3例。所有患者均予环磷酰胺（Cy）＋依托泊苷（VP16）＋标准分次全身放疗（fTBI）预处理方案。结果所有患者均成功植活，白细胞、血小板植入中位时间分别为第15（10-22）天和第20（10-65）天。Ⅱ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病（aGVHD）3例（19%），慢性GVHD（cGVHD）7例（43%）。11例（68.75%）患者长期生存，中位生存期75（34-82）个月。6年总体生存率（OS）68.75%，其中第一次完全缓解或慢性粒细胞白血病慢性期患者6年OS为78.75%。6年复发率14.29%，移植满2 a后无患者复发。结论Cy-VP16-fTBI预处理方案的造血干细胞移植安全、有效，其长期疗效明显优于常规化疗。aGVHD发生率较低，但cGVHD在异基因外周血干细胞移植中发生率较高；其他毒副作用较少。

将Pti5-VP16基因导入烟草的研究

以烟草叶片为外植体,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将番茄Pti5-VP16基因导入烟草中。经卡那霉素筛选,获得了27株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增和Southern杂交分析,证明抗性植株中整合了Pti5-VP16基因,表明所构建的含Pti5-VP16基因的植物表达载体pBI121UCH1具有正确的阅读框,并能在异源植物中表达。

抗癌药VP16-213合成工艺的改进

鬼臼脂素经脱甲基化、酰化、缩合、脱酰制得抗癌药足叶乙甙（ Ｖ Ｐ１６２１３），总产率 １７２％ ，较老工艺有明显的改进。

VP16与细胞凋亡

鬼臼乙叉甙（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ＶＰ１６）是人工半合成的鬼臼毒素类细胞毒药物，于１９７１年开始临床使用，１９８３年获得美国ＦＤＡ批准［１，２］。二十多年的临床应用表现：ＶＰ１６对许多实体瘤及造血系统恶性肿瘤有明显疗效［３，４］，已成为临床上主要的化疗...

VP16对人类白血病细胞系K562细胞诱导分化作用的研究

目的 研究足叶乙甙 (VP16 )对K56 2细胞分化的诱导作用。方法 K56 2细胞在含0 .4 μg mlVP16的培养液中培养 72h ,观察K56 2细胞NBT还原能力和吞墨功能 ,以及细胞化学和超微结构的变化。结果 0 .4 μg mlVP16可使K56 2细胞NBT还原能力和吞墨功能增强 ,细胞内过氧化物酶、糖原和α 萘酚酯酶含量增加 ,电镜下可见细胞体积变小 ,微绒毛和线粒体减少 ,核异染色质增加。结论 VP16诱导K56 2细胞向粒单细胞系分化。

N-cadherin阳性白血病KG1a细胞系在G_0期抵抗VP16杀伤的作用

抗药性是白血病干细胞的重要特征,为探索N-cadherin阳性的白血病细胞耐受化疗药物VP16杀伤作用的机制,本研究以白血病细胞系KG1a为研究模型,利用流式细胞术测定N-cadherin阳性和N-cadherin阴性细胞在G0期比例的差异,利用G-CSF诱导KG1a细胞进入细胞周期,观察G0期细胞比例的变化,并测定诱导后KG1a细胞对VP16的敏感性;再利用EGTA抑制N-cadherin介导的细胞间黏附后,观察KG1a细胞耐药性的变化。结果显示,N-cadherin阳性的KG1a细胞G0期比例高于N-cadherin阴性的细胞;诱导KG1a细胞进入细胞周期后G0期细胞比例明显下降,KG1a细胞对VP16的敏感性显著升高;利用EGTA处理KG1a细胞24小时抑制N-cadherin的作用后,KG1a细胞在G0期比例降低,KG1a细胞对VP16的药物敏感性显著升高。结论:N-cadherin通过介导白血病细胞之间的黏附作用,使白血病细胞处于G0期的静息状态,从而耐受VP16的杀伤作用。

利用Gal4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性

目的:确立基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法:将插入上游激活序列(UAS)和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌合酵母活性转录因子(Gal4)、单纯疱疹病毒蛋白(VP16)和γ-分泌酶切割位点的质粒C99-GVP,以及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV,用脂质体转染法转入稳定表达淀粉样前体蛋白C末端的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用免疫沉淀Westernblot分析法检测β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,利用Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果:免疫沉淀Westernblot分析表明A(的生成在γ-分泌酶激活剂神经节苷脂GM1作用下升高并呈剂量依赖性,同时双荧光素酶法检测γ-分泌酶活性也同步升高。在γ-分泌酶抑制剂作用下Aβ的产生呈剂量依赖性的减少,同时γ-分泌酶活性也同步降低。结论:基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性的方法有效可靠,是一种敏感、定量的检测方法。

生存素在VP16诱导HL-60白血病细胞凋亡中的作用

目的探讨生存素在化疗药物足叶乙甙(VP16)诱导白血病细胞凋亡中的作用。方法用HL60白血病细胞株进行传代培养,MTT试验检测VP16不同药物浓度对白血病细胞增殖的影响。通过光镜下观察细胞形态学变化和DNA凝胶电泳定性检测细胞凋亡,用流式细胞术(FCM)定量检测细胞凋亡及周期变化,用RTPCR检测生存素基因表达,免疫组化检测其蛋白表达。结果各种浓度的VP16均可诱导HL60细胞凋亡,下调生存素表达,阻滞细胞周期,具有明显时间和浓度依赖性。结论VP16诱导白血病细胞凋亡可能与其抑制生存素表达有关。

TNFα联合VP16对肺腺癌细胞株抑制、粘附分子表达及细胞周期的影响

目的 研究肿瘤坏死因子 (TNFα)和足叶乙甙 (VP16 )联合对肺癌细胞包株的作用及其机制。方法 用MTT法检测不同浓度的TNFα、VP16及TNFα联合VP16对人肺癌细胞系A5 4 9的细胞毒作用以及用间接荧光标记法、流式细胞仪观察TNFα、VP16及TNFα联合VP16对A5 4 9的细胞周期、粘附分子表达的影响。结果 TNFα、VP16对A5 4 9细胞的生长抑制作用有剂量依赖关系 ,而TNFα联合VP16对A5 4 9抑制作用较TNFα、VP16作用显著 (P <0 .0 1)。TNFα、TNFα联合VP16能上调CD5 4表达 ,与VP16均能上调CD95表达 ,而粘附分子CD11α、CD18、CD4 0、CD80、CD137等用药后仍不表达。对细胞周期用药后G2 期明显下降 (13.2 %下降至 3.0 % ) ,S期上升 (2 7.3%上升至 4 2 .5 % )。结论 TNFα联合VP16增加A5 4 9的抑制率 ,增强CD5 4、CD95表达。推测TNFα联合VP16对A5 4 9细胞的作用是通过抑制DNA合成及有丝分裂 ,使G0 +G1+S期不能及时转至G2 。