抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定及VP2蛋白的原核表达

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达VP2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对VP2蛋白进行诱导表达、可溶性分析、纯化及Western-blot鉴定。结果表明:从临床病料样本中分离到1株病毒,将该毒株接种鸭胚,鸭胚的死亡时间均集中在接种后的第48~72小时之间,死亡鸭胚出现绒毛尿囊膜增厚、胚体有大量出血点、鸭喙短小等短喙侏儒综合征的典型病变特征,将分离毒株命名为SCNC01株。SCNC01株不能凝集1%鸡红细胞,在其基因组DNA中可扩增出NGPV NS1基因序列,该序列与GenBank中的NGPV NS1基因序列相似性在90.6%~98.3%之间,SCNC01株与MK000549、MN415966、JF333590、KC996729、KT598506、MW929338等NGPV毒株处于同一分支,确定该毒株为NGPV。SCNC01株的ELD_(50)为1×10^(-4.5)/0.2 mL,可引起雏鸭出现运动障碍、食欲下降、精神萎靡、喙萎缩、舌头外翻、排白色稀便等临床症状甚至死亡。经IPTG诱导NGPV VP2蛋白获得了表达,且表达形式为包涵体,经His-Tag蛋白纯化柱纯化后,出现与目的蛋白大小一致的单一条带,该蛋白能与NGPV阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。说明试验成功分离到1株鸭源NGPV,并获得了具有良好反应原性的VP2蛋白。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

抗传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal bursal virus,IBDV)引起的一种高度传染性疾病,以雏鸡法氏囊萎缩、腿肌出血等为特征性病变,给世界家禽产业造成重大经济损失。目前,由新型变异株引起的IBD在我国呈现流行趋势。为建立基于IBDV VP2蛋白的免疫学诊断技术,本研究以新型变异毒株IBDV-LY21/2为模板,扩增其VP2基因,随后构建重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-IBDV-VP2并转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测重组蛋白His-VP2的表达情况,并对其进行纯化和浓度测定。将His-VP2免疫BALB/c小鼠后,采用iELISA检测血清抗体效价,最后制备单克隆抗体并对其鉴定。结果显示,获得的重组蛋白His-VP2分子量约为50 kDa,浓度为8 mg/mL;通过两次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株1G10F12、3E3E9、4D12G12,且重链均为IgG1型,轻链均为κ型;其中1G10F12、3E3E9可与重组蛋白Myc-VP2产生Western blot和IFA反应,而4D12G12只能与其产生IFA反应。本研究为IBD诊断方法的建立奠定了基础,同时为深入研究VP2蛋白的功能提供生物学工具。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

表面展示传染性法氏囊病病毒VP2蛋白细菌样颗粒的构建与鉴定

为构建表面展示传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的细菌样颗粒(bacterium-like particies, BLPs),试验分别克隆VP2基因和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor, PA)基因片段,通过融合PCR技术构建VP2-PA融合基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建重组杆状病毒rBV-VP2-PA,将表达产物与裸露BLPs共孵育,在PA的介导下,构建表面展示IBDV VP2蛋白的细菌样颗粒(BLPs-VP2);依次采用透射电镜观察、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光对BLPs-VP2进行鉴定。结果表明:VP2蛋白获得成功表达并展示于BLPs表面,可与IBDV阳性血清发生特异性结合,1 U(2.5×10~9颗粒)BLPs最大可负载约107μg VP2-PA融合蛋白。说明构建的IBDV VP2蛋白BLPs可用于传染性法氏囊病(IBD)新型亚单位疫苗的研发。

鸡IBD病毒免疫原性VP2蛋白全悬浮培养工艺的研究

为获取高稳定性、高均一性、高效价的鸡IBD病毒免疫原性VP2蛋白亚单位苗,本研究通过对不同的温度、病毒接毒量、细胞密度、收获时间、pH、溶氧(DO)、转数等培养条件,对鸡IBD病毒免疫原性VP2蛋白在SF9全悬浮细胞上培养工艺进行了优化,筛选出了最佳的全悬浮培养工艺,用该工艺制备免疫原性VP2蛋白,灭活后配制成疫苗,并进行安全性、效力等检验。结果表明,抗体效价高于国家标准,免疫SPF鸡后安全性合格,均未出现不良反应,此培养工艺为SF9全悬浮细胞规模化和工业化生产鸡IBD病毒免疫原性VP2蛋白提供依据和理论基础,新型鸡IBD病毒免疫原性VP2蛋白亚单位苗研究,对鸡IBD的防控具有重要意义。

传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价

【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株(vaIBDV)VP2蛋白原核表达质粒,并明确VP2蛋白的免疫原性,为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。【方法】从IBDV新型变异株(BZ)中扩增VP2基因片段,亚克隆至pET-28a(+)载体上构建重组原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡,通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。【结果】在25℃下以IPTG进行诱导表达,获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表达,大小约40 kD,且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应,其琼扩效价可达1∶32;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好,安全性高,无免疫引起的不良反应,剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8,而血清抗体效价均在1∶20000以上,表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应,抗体阳性率达100%;使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况,结果显示免疫组鸡只均未发病,其法氏囊也无明显萎缩现象,即免疫保护率达100%。【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达,且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好,能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果,为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。

犬细小病毒VP2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

基于牛肠道病毒重组VP2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为了解牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)在我国牛群中的感染情况,建立了基于BEV VP2蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果发现重组VP2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶性形式表达。间接ELISA检测方法其抗原包被最佳浓度为100 ng/孔,最佳封闭条件是10%马血清封闭1.5 h,一抗最佳稀释度是1∶100,二抗最佳稀释度是1∶200。该方法具有良好的特异性、重复性和灵敏性,与间接免疫荧光方法相比较,符合率为92.3%。对全国7个不同省市的1 964份牛血清样本进行检测,显示总体阳性率为52.6%,表明BEV已在我国牛群中普遍流行。本试验建立的BEV抗体间接ELISA方法,为BEV感染的诊断和血清学调查提供了技术支撑。

鸡细小病毒NS1和VP2蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2,将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达,优化表达条件,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体(SPF)鸡获得多克隆抗体,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价,以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析显示,NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104和87 kD,与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选,结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度1.0 mmol/mL,16℃诱导表达过夜;VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL,20℃诱导表达过夜。可溶性分析显示,NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在;间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1∶10 240 000;Western-blotting鉴定表明,His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合;IFA分析显示,VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】本研究成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体,可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白,并对其免疫原性分析。方法将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后,用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后,可成功表达MVM VP2重组蛋白,经Western blot和IFA检测分析,重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性,为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。

GⅡ.4型诺如病毒VP2蛋白生物信息学分析

为了解诺如病毒VP2蛋白的生物学特征,该研究以当前诺如病毒GII.4型流行毒株VP2蛋白为研究对象,应用生物信息学软件对VP2蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位进行预测分析。结果表明,诺如病毒流行毒株VP2蛋白为稳定的亲水性蛋白,平均等电点为10.47、吸水系数为-0.47、不稳定系数为47.91,碱性氨基酸约占含量的11.60%;该蛋白含有约43个潜在的磷酸化修饰位点和2个潜在的糖基化修饰位点;大多数毒株不存在跨膜区和信号肽,然而GI.3型诺如病毒VP2蛋白存在跨膜区和信号肽;诺如病毒VP2蛋白二级结构中α-螺旋平均占比38.17%、延伸链平均占比7.45%、β-折叠平均占比6.25%、无规则卷曲平均占比48.13%;三级结构预测模型的蛋白覆盖率为56.70%;平均存在8个潜在的蛋白质抗原决定簇和25个B细胞抗原表位。该研究运用生物信息学分析方法预测当前GII.4型诺如病毒流行毒株VP2蛋白的理化性质和结构等方面,为进一步深入研究诺如病毒VP2蛋白功能奠定了理论基础。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要危害3～6周龄的雏鸡。该病于1957年首次发现于美国Gumboro地区。50年来，IBD一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（vvIBDV）的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（OIE）已将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌诱导小鼠产生特异性抗体

【目的】研究以干酪乳杆菌作为传递抗原活载体表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白的免疫特性。【方法】将构建的重组猪细小病毒(PPV)VP2基因的细胞表面表达型载体pPG-VP2电转化干酪乳杆菌L.casei393,获得阳性重组菌pPG-VP2/L.casei393。重组菌以2%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,经SDS-PAGE、Westernblot及间接免疫荧光分析,目的蛋白获得表达。将重组菌及空质粒菌株分别口服接种Balb/c小鼠,收集粪便及肠黏液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性sIgA,采集血液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性IgG,并对获得的抗体进行PPV中和活性的测定。【结果】重组干酪乳杆菌pPG-VP2/L.casei393免疫小鼠能够产生明显的抗PPV的sIgA和IgG抗体水平,其对PPV的中和效价分别为1﹕24和1﹕128。【结论】为PPV重组乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要的物质基础。

传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定

为鉴定IBDV VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份。应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性。结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1∶105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合。本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础。

番鸭细小病毒MDPV-Q株VP2蛋白基因的克隆与序列测定

根据genebank中番鸭细小病毒 (MDPV)的基因序列 ,设计了一对引物LHMP7/LHMP8,同时在这 2条引物中分别加入 2种限制性核酸内切酶SacII和KpnI的酶切位点 ,使扩增后的DNA片段的两端 ,分别含有这 2种酶的酶切位点。应用PCR技术扩增了MDPV_Q株的VP2蛋白基因片段。将扩增后的VP2蛋白基因重组到pMD18_T质粒载体上 ,并对插入片段进行序列测定。测序结果表明 ,我国分离的MDPV_Q株基VP2蛋白基因序列与国外分离株的同源性达 97.9%。

猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌中的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

将分别编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原VP2蛋白的重组基因插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2-E290,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白的乳酸菌共表达系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约70kDa蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot分析结果表明所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以诱导表达上清液作为抗原进行的间接ELISA实验也表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品检测小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体,采集血液样本检测血清中抗PPV及抗E290的特异性IgG。结果表明分泌型的重组菌pPG-VP2-E290/L.casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗体水平,为重组猪瘟与猪细小病毒乳酸菌口服活菌疫苗的研制奠定了重要的物质基础。

蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备蓝舌病病毒03TV）8型VP2蛋白的单克隆抗体（MAb）TL鉴定其抗原表位，本研究采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达并纯化的重组VP2蛋白免疫BALB／c小鼠，三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2／0细胞进行融合，并以纯化的重组VP2蛋白为包被抗原，通过间接ELISA筛选出两株能够稳定分泌抗BTV8VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株（2G4和387）。间接免疫荧光结果表明：2G4和387与BTV8均呈阳性反应，与BTV1～7、BTV9-24、茨城病毒、中山病毒以及赤羽病毒均呈阴性反应。Westernblot结果显示，2G4和387均能够识别BTV8及BTV8重组VP2蛋白。Ig亚类鉴定2G4和387均为IgG1／κ链。利用原核表达的96条覆盖VP2全长的麦芽糖结合蛋白（MBP）融合短肽对MAbs的抗原表位进行鉴定，结果表明：MAb2G4识别的抗原表位为捌LCRLLSTIGRKMCNTE^296。本研究结果为BTV8型特异性检测方法的建立及VP2蛋白结构和功能的研究奠定了基础。

水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表达及其检测应用

将构建好的重组质粒pMD-VP2a、pMD-VP2b分别经双酶切获得基因片段VP2a、VP2b,分别将其定向插入到原核表达载体pMAL-c2中,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,经IPTG诱导,两段基因均获得表达;Westernblot分析表明表达蛋白具有良好的抗原性。用KCI染色后,切胶回收的方法对表达蛋白进行纯化,以纯化的目的蛋白作为诊断抗原初步建立了水貂阿留申的VP2-CIEP诊断方法。结果表明该方法具有较高的灵敏性和特异性,与传统的CIEP方法的检出符合率达94.3%。