贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。

农杆菌介导鼠源轮状病毒vp4基因转化马铃薯条件优化研究

目的 获得马铃薯再生和农杆菌介导的遗传转化体系。方法 以马铃薯品种“台湾红”为受体材料 ,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。结果 诱愈培养基为MS + 0 1mg L 2 ,4-D + 1mg LBA ,出芽培养基为MS + 1mg LZT +5 0mg LGA3 ,卡那霉素浓度为 5 0mg L ,农杆菌液浓度为A6 0 0 =0 5。通过该体系将一鼠源轮状病毒外壳蛋白基因vp4导入马铃薯中 ,获得了具卡那霉素抗性的转化植株。经PCR验证 ,外源基因已导入马铃薯基因组中。结论 获得相对高效的马铃薯遗传转化体系 ,并成功地将外源基因转入马铃薯中。

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种,通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究,从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行nptII基因的PCR检测,结果有22株能扩增出620bp左右的nptII基因条带,阳性率约为84.62%。提取nptII基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板,用VP4基因特异引物进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,所有nptII基因阳性的植株均扩增出了约2350bp的特异性条带,而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析,发现转基因植株中出现了阳性杂交信号,表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中,并且是1-2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株,证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录,利用Westernblot方法检测筛选到的4株转基因花生,分别提取其蛋白,在30kD处出现特异性蛋白条带,这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。

2007—2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析

为了解2007-2008年北京地区流行的肠道病毒71型(EV71)是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系,我们选择2007年分离的3株EV71(其中1株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本,其余2株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本)和2008年分离的5株EV71(其中3株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本,2株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本),提取基因组RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到VP4基因片段,并进行核苷酸序列测定,使用生物信息软件与GenBank中的EV71 VP4基因进行序列及病毒型别分析。结果表明,所测得的8株EV71 VP4基因全长均为207bp,编码69个氨基酸,理论相对分子质量(Mr)为7×103。8株EV71病毒VP4基因的核苷酸同源性在94%～100%,与GenBank中其他EV71病毒株VP4的核苷酸同源性为82%～100%,与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4编码的氨基酸在第7和54位不同外(印度株:7位蛋氨酸,54位苏氨酸;其余株7位苏氨酸,54位丙氨酸),这8株EV71VP4编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8株EV71病毒VP4与文献报道的3株重症感染病毒株VP4(BrCr、MS和NCKU9822)核苷酸有较大差别,而8株病毒株中从重症感染(BJ97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243)与轻症感染(BJ25、BJ47、BJ65和BJ67)分离到的毒株之间VP4基因序列未见明显改变,只有几个核苷酸存在差别。VP4核苷酸序列的进化树分析表明,这8株EV71均属于C4亚型,显示2007-2008年北京地区流行的EV71的VP4基因相当保守,分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71的VP4基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示,近2年来北京地区所流行的EV71属C4亚型。

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析

为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87ku的重组蛋白。Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应。大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验。结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础。

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株 JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1 756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得 vp4 基因的表达,对表达的 VP4 蛋白进行 Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株 CRW 8 株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明 JL94株与 CRW 8 株属同一 VP4 血清型,而与 Gottfried株属不同血清型。JL94 株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于 aa81 aa207。vp4 基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的 20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断 JL94 在 MA104 细胞上引起的细胞病变。

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。

猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计—对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析。结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98％和98.05％,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型。本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。

草鱼呼肠孤病毒096 vp4基因生物信息学分析及其在肾细胞中的表达

克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的vp4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株vp4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株vp4基因间却存在很大的差异。GCRV 096 VP4蛋白含有多个功能位点、2个跨膜结构域及多个潜在的抗原决定簇。构建p EGFP-N3-VP4真核表达质粒,并转染至草鱼肾(Ctenopharyngodon idellus kidney,CIK)细胞中,经荧光显微镜观察和Western blot鉴定,表明GCRV 096 VP4融合蛋白在CIK细胞中得以成功表达。

用大引物PCR法获得轮状病毒VP4基因的突变体

目的 对A组轮状病毒主要结构抗原VP4基因中PacⅠ的识别序列进行无义突变以便于用腺病毒Ad Easy载体系统进行表达。方法 采用大引物PCR方法 ,通过 3条引物 ,两轮PCR反应 ,获得VP4基因的突变体 ,并经核酸序列分析证实。结果 PacⅠ识别的 8个碱基序列TTAAT TAA ,突变为CTGATCAA。结论 大引物PCR是对核酸进行突变的一种简便。

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用SalⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和（以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）及红霉素基因（Erythromycin）为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的）质粒载体pW425et，并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4，并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E-coliX13和乳酸杆菌感受态中，经生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性。

猪A组轮状病毒pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的构建及表达

以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析。结果表明,在MRS培养基中加入1%甘氨酸+0.3mol/L蔗糖,电场强度为11kV/cm,脉冲时间为3.8ms,电击后细胞复苏3～4h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。

肠道病毒71型SHZH03株VP2和VP4基因的进化分析

目的:对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(中国台湾98年、日本99年及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的VP2和VP4基因进行了遗传进化分析.方法:在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA-STAR软件对VP2和VP4基因进行遗传进化分析.结果:SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的中国台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异.结论:中国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于中国台湾1998年EV71大规模流行时的毒株.

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增了 816 bp的 VP4片段中抗原表位区。通过 T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒 p GEM- T上 ,转化至受体菌 DH5 α中。提取质粒经 PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒 p T- V4中含有轮状病毒的 VP4基因片段。经核苷酸序列分析 ,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原

鸡传染性法氏囊病病毒PCR检测及VP4基因序列分析

从滨州地区某养鸡场疑似鸡传染性法氏囊病病鸡初步分离到一株记为HSJ12分离株的IBDV毒株,从该分离株中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增VP4基因。结果表明,测序结果与GenBank中报道的IBDV VP4序列同源性在95%～99%之间。将VP4基因测序序列与GenBank上报道的23个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与ks株同源性最近,而与23-82、OH株同源性最远。

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D600nm值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸+0.3mol/L蔗糖,电场强度为11kV/cm,脉冲时间为3.8ms,电击后细胞复苏3～4h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。

VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型(EV71)非柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)手足口病(HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物EVP4/Q8和VP1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用EVP4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型(CoxA10);将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。

牛轮状病毒VP4基因RT-qPCR检测方法的建立

旨在建立快速特异的牛轮状病毒(BRV)实时荧光定量PCR检测方法,用于病原初步筛查。首先以BRV VP4作为目的基因,通过查询Genbank设计合成引物,然后将扩增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T载体中,构建重组质粒标准品,最后经优化反应条件,建立了最低检测量可达7.21 copies/μl的EvaGreen荧光定量检测方法。经验证,该方法特异性好,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性;重复性较强,组内重复和组间重复变异系数分别为0.95%~1.12%和1.55%~2.18%。此外,利用该方法检测了21份ELISA阳性样本,测得阳性符合率为90.47%。本研究建立的BVR VP4 RT-qPCR检测方法特异、敏感、可重复,可用于病原的快速检测,为BRV临床诊断提供了一种高效、可靠的检测方法。