1株悬浮培养的Vero细胞驯化及其生物学特性研究

目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究。方法 采用无血清培养和“摇床适应法”对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测。结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在24~72 h,平台期在108~144h之间,衰退期在144h以后,细胞PDT为36 h,细胞密度在14.01~14.88×10^(8)个/L之间,细胞平均圆度在0.73~0.75之间,细胞直径在12.12~14.44μm之间。Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感。结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长。STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别。为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究。

新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较

目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87在DF-1细胞和Vero细胞感染性研究

为比较传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗株B87对DF-1细胞和Vero细胞易感性,对比了IBDV B87株感染两种细胞后的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒基因组dsRNA、半数组织感染量(median tissue culture infective dose,TCID 50)水平、病毒载量及VP2基因表达水平。结果显示,IBDV B87株感染后,DF-1细胞CPE程度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒基因dsRNA荧光密度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒载量荧光密度高于Vero细胞,且DF-1细胞中病毒滴度(105.423±0.03296 TCID 50/0.1 mL)极显著高于Vero细胞中病毒滴度(102.592±0.03428 TCID 50/0.1 mL,P<0.01),VP2基因表达量显著高于Vero细胞(P<0.05)。说明IBDV B87株对DF-1细胞的感染性高于Vero细胞。

无血清全悬浮培养Vero细胞系的建立及生物反应器培养参数优化

为建立无血清全悬浮培养Vero细胞系,并使其在反应器中高密度生长。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)引进贴壁培养型Vero细胞,通过降低血清浓度和改变培养液的方式获得1株无血清全悬浮培养型Vero细胞,扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型等特性进行检定;通过Box-Behnken试验对生物反应器pH、溶氧和搅拌转速等3个培养参数进行优化,确定最优培养参数。结果显示,筛选的Vero悬浮细胞形态呈圆形、饱满、透亮,大小均匀,呈现较好的悬浮生长状态;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体数目为58或60的占75%;用响应面分析法得出的最优培养参数培养Vero细胞,细胞最高密度可达4.5×10^(6)cells/mL。结果表明,成功筛选出了适应无血清悬浮培养的Vero细胞,通过优化培养参数,可在生物反应器中高密度生长。

Vero细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量关系的研究

目的:建立一种应用于片状载体培养的Vero细胞计数方法。方法:Vero细胞于细胞瓶内培养,分别于24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取样检测上清液中葡萄糖含量,同时消化细胞并计数。以葡萄糖累计消耗量为X轴,以细胞收获数量为Y轴,获得葡萄糖累计消耗量和细胞数量的关系方程,从而建立一种细胞计数的方法。通过计算反应器中细胞生长消耗的葡萄糖量来计算细胞数量,从而优化控制细胞生长。结果:得到葡萄糖消耗量与细胞数量线性方程为Y=4.107×10~8X;Vero细胞在反应器内培养6 d,累计消耗葡萄糖71.28 g,所获得细胞数量为2.93×10^(10)个。结论:建立了葡萄糖消耗量与细胞数量的线性关系,即每消耗1 g葡萄糖对应的细胞数量为4.107×10~8个,可作为片状载体细胞培养过程中细胞计数的参考。

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化。方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein ASepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化。结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP。结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP。

微载体高密度培养Vero细胞的研究

微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｃｙｔｏｄｅｘ３、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ、Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ＣＴ－１、ＣＴ－３、ＭＣ－１、ＣＴ－２８种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Ｂｉｏｓｉｌｏｎ作为Ｖｅｒｏ细胞高密度培养的首选微载体。用５００ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎ搅拌瓶探索影响Ｖｅｒｏ细胞高密度培养的条件。

国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性

目的观察国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性。方法观察组200例和对照组50例暴露后,按照0、3、7、14、28d免疫程序,分别接种国产、进口冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。观察组接种疫苗后,观察全身和局部反应情况。采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测观察组和对照组接种后的血清中和抗体水平。结果观察组疫苗接种后,局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒发生率分别1.4%、0.8%、17.1%和2.4%;全身反应发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他反应发生率分别为1.2%、0.4%、2.4%、4.2%和0.3%,且在第7天完全消失。观察组与对照组疫苗首剂接种后7d,抗体阳转率分别为40.3%和37.0%,14d分别为95.5%和97.7%,差异无统计学意义;且首剂接种后45d,抗体阳转率均为100%。观察组和对照组疫苗首剂接种后7、14、45d,血清中和抗体GMT差异无统计学意义,14、45d血清中和抗体GMT均大于0.5IU/ml。结论国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)接种反应轻微,并具有良好的免疫原性。

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。

Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺

概述了用微载体系统培养贴壁细胞放大过程中的接种方法，研究了球转球的工艺条件，并建立了球转球的动力学模型。用此方法成功地在国产５０Ｌ生物反应器中培养Ｖｅｒｏ细胞，细胞密度达１．１×１０７ｃｅｌｓ／ｍＬ。

国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果

目的观察国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果。方法对93名观察对象采用0、3、7、14和28 d程序进行暴露后免疫,观察免后30 min的即时反应及72 h内的局部和全身副反应,并于第1针免疫后3、7、14和45 d采血,检测血清抗体水平。结果疫苗接种后均无异常反应,局部及全身一般反应率分别为5.8%和4.5%。免后7 d,血清抗体阳转率达22.58%,14 d达100%;免后7、14和45 d的GMT差异有显著意义;不同性别间免后14和45 d的GMT差异均无显著意义;不同年龄组间GMT14 d差异有显著意义,45 d差异无显著意义。结论国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗安全,免疫效果好。

斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的:为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法:将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和 HindⅢ内切酶进行断链处理,电泳和序列分析并确定DNA片段长度,地高辛标记后制备成检测探针,测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果:HindⅢ内切酶处理断链后产生172 bp、344 bp、516 bp、688 bp不同长度的DNA,并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30 s的DNA长度为500～750 bp的DNA片断作为检测用探针。结论:两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0.1 pg,重复性均较好,超声波处理的探针特异性优于酶切探针,并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的 采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法 用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果 培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论 用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。

β-丙内酯在Vero细胞HFRS疫苗中的应用

目的 探讨 β -丙内酯灭活双价Vero细胞肾综合征出血热纯化疫苗的最佳条件。 方法 采用不同终浓度的 β-丙内酯和不同的灭活时间对疫苗进行灭活 ,用细胞培养法进行病毒增殖试验 ,以确定灭活效果。应用高效液相色谱法分析 β -丙内酯的最佳水解条件和 3批双价vero细胞出血热纯化灭活疫苗 β-丙内酯残留量。检测 3批双价纯化灭活疫苗的免疫效果。结果 疫苗经终浓度为 1∶2 0 0 0和 1∶4 0 0 0的 β -丙内酯作用 2 4h ,均可完全灭活病毒 ;疫苗中的 β-丙内酯在 37℃水浴下 ,随着水解时间的延长 ,其含量逐渐下降 ,水解 2h后已无 β-丙内酯检出 ;3批经 β-丙内酯灭活的双价Vero细胞出血热纯化疫苗均未检出 β-丙内酯残留 ,在家兔体内诱导产生针对汉滩型和汉城型病毒的中和抗体效价均达到 1∶2 0。结论 肾综合征出血热纯化疫苗经终浓度为 1∶4 0 0 0 β -丙内酯 4℃灭活 2 4h ,然后再于 37℃水浴中水解 2h ,既可达到完全灭活病毒且无 β-丙内酯残留的目的 ;

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。

应用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒

目的 研究用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒W株的可行性。方法 Vero细胞悬浮吸附HAVW株后 ,接种到搅拌式生物反应器中 ,用微载体进行培养 ,对营养物质、代谢产物及病毒的增殖进行分析。结果 经四周的培养 ,病毒收获时 ,细胞密度达 1.4× 10 6 ml,甲肝病毒抗原滴度达 1∶64。结论 W株已适应于Vero细胞中 ,用生物反应器培养产毒 。

Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究

将“北京”及“CTN”两株中国分离的狂犬病病毒毒株适应于Vero细胞,病毒滴度可达10^(7.5)LD_(50)/ml。应用Veto细胞微载体反应器系统培养病毒,经丙内酯灭活,超滤浓缩制备的疫苗,其效力试验(NIH法)结果优于现行原代地鼠肾细胞培养疫苗。

利用生物反应器和Vero细胞培养鸡传染性法氏囊病病毒的研究

通过对血清、pH、接毒量和收毒时间等培养条件的优化 ,确定鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)在Vero细胞上增殖的最佳培养条件为 :血清 2 %,pH 7.0 ,接毒量 5∶10 0 0 0 ,收毒时间为接毒后培养 10 8h。 2 5 0ml自制搅拌瓶和 5L搅拌式生物反应器研究结果表明 ,在 2g/L微载体的Vero细胞悬浮培养系统中 ,待细胞刚长满微载体时 ,按照确定的IBDV最佳增殖条件换液培养 ,病毒可在较长一段时间维持高的病毒滴度 ,最高滴度分别可达 8.875和8.5 8(-lgTCID50 ) ,比传统转瓶生产方法至少提高 1个毒价 ,可用于IBDV规模化生产。

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞上的适应传代研究

本文报导了用我国狂犬病毒固定毒人二倍体细胞适应株（ＣＴＮ－１）进行Ｖｅｒｏ细胞适应传代研究。通过连续传代培养，滴度可达８．０ｌｏｇＬＤ_（５０）ｍｌ，达到了ＷＨＯ规定的不需浓缩的标准。病毒用０．０１ＭＯＩ感染细胞其产量与１Ｍｏｌ感染量相仿。病毒增殖高峰在４－５天，维持达１５天无明显下降，且可连续收获４－５次。因此，该毒种符合ＷＨＯ提出的疫苗生产毒种要求，可用于狂犬病疫苗生产。