干旱胁迫下麻疯树毒蛋白的Western杂交分析

用 10 %～ 4 0 %聚乙二醇 (PEG 6 0 0 0 )处理麻疯树幼苗进行蛋白质诱导 .SDS PAGE显示 ,在根、茎、叶中分别诱导出分子量大约为 17和 30kD、17和 35kD及 15、17、32、5 3、5 6、6 1和 6 5kD的蛋白质多肽链 .用麻疯树毒蛋白(curcin)的抗血清与诱导蛋白进行Western杂交 .结果显示 ,在叶的诱导蛋白中出现分子量为 32和 6 5kD的阳性反应带 ,而在根、茎中无 .这一结果表明干旱胁迫下麻疯树蛋白质分子标记的存在 ,为逆境蛋白的研究奠定了实验基础 .

一种改进的Western杂交方法

Western杂交是一种检测蛋白质的免疫化学方法,已在生物科学的许多领域得到广泛应用,但以前的文献介绍的Western杂交程序过于繁琐。本文根据Western杂交的基本原理结合已报道资料进行了一些改进,并应用到猪血清瘦素蛋白的检测。该程序简单易操作,结果清晰,证明改进后的方法完全可行。

鸡肌肉组织实时荧光定量PCR及Western杂交内参基因的筛选

本研究对5种常用"持家基因"作为鸡肌肉组织发育早期基因和蛋白检测内参基因的有效性进行了评价,为鸡肌肉发育相关分子检测中内参基因的选择提供科学依据。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技术,分别检测了鸡12胚龄、17胚龄、1日龄和14日龄胸肌中β肌动蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA结合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和热休克蛋白70(HSP70)的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,在鸡发育早期胸肌组织中,仅HSP70mRNA和蛋白在各阶段间表达水平差异不显著,GAPDH、TUBB、TBP和ACTB的mRNA和蛋白表达水平在检测的各个时间点间均差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。HSP70更适合作为鸡肌肉发育早期基因和蛋白检测的内参基因。本结果为研究发育期鸡肌肉组织相关功能基因和蛋白提供了必要的方法学基础,对其他物种的相关研究也有重要借鉴意义。

2-D电泳结合ECL Western杂交分离鉴定大鼠肝82kD蛋白

２－Ｄ电泳结合ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎ杂交分离鉴定大鼠肝８２ｋＤ蛋白６１００８３成都成都军区总医院雷士泽刘晓波林万芳①关键词电泳；Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交；蛋白质分离中国图书资料分类号Ｒ３６２２－Ｄ电泳是分离粗提蛋白强有力的手段。它能根据分子量和等电点（ＩＥＰ...

蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3蛋白表达的影响

目的:观察采用蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法探讨葛根素通过TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3对于促进成骨细胞增殖分化机制的研究。方法:原代培养新生小鼠成骨细胞,分别用空白对照组(含10%DMEM)及3种不同浓度分别为1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL的葛根素干预液处理成骨细胞。采用MTT实验法检测葛根素对成骨细胞生长的影响,Western Bloting法检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3表达的影响。结果:不同浓度的葛根素有促进成骨细胞生长的作用,并可以提高TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3的表达,呈浓度依赖性,分别与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:葛根素可以通过TGF-β1及Smad 2/3信号转导途径促进成骨细胞增殖与分化。

西红花苷对大鼠实验性高脂血症的影响及其机制研究

目的观察西红花苷对实验性高脂血症的影响并探讨其作用机制。方法采用高胆固醇饮食饲养SD大鼠2个月,造成高脂血症模型,观察西红花苷对大鼠血脂质的影响。此外体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC),以加高脂血清和加西红花苷等不同培养基分组培养,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)法检测平滑肌细胞活性,以Western杂交检测p38MAPK磷酸化。结果西红花苷能明显降低血胆固醇,甘油三酯、LDL含量,升高HDL及其亚型含量。西红花苷可明显抑制高脂血清培养下SMC的增殖,其吸光度低于造模组。高脂血清组磷酸化p38MAPK的表达有所增加,加入西红花苷后可显著降低p38MAPK的活化,并能逆转高脂血清诱导的SMC增殖。结论西红花苷可有效地调整脂蛋白代谢,抑制SMC增殖,并通过抑制p38MAPK而使平滑肌细胞增殖减少,从而防治高脂血症、阻止动脉粥样硬化发生发展。

瘦肉型与脂肪型猪血清Leptin的比较检测

为了研究我国脂肪型猪与引入的瘦肉型猪ob基因的蛋白表达差异,用Western杂交比较检测了内江猪、八眉猪、长白猪和杜洛克猪的血清Leptin水平。结果发现,脂肪型猪体内存在Leptin抵抗现象,血清Leptin水平比瘦肉型猪高3.23倍;同时发现一个大小约为33ku的蛋白与Leptin有一定的结构同源性,该蛋白也可能是Leptin的二聚体;另外,脂肪型猪ob基因的表达高于瘦肉型猪,二者肥胖程度和瘦肉率性状的差异可能还存在与ob基因表达有关的机制。

玉米ZmSCL7的克隆及功能研究

【目的】对玉米SCARECROW-LIKE 7(SCL7)进行克隆与表达研究,了解该基因表达的分子机制及其应用。【方法】以玉米叶片总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得ZmSCL7的全长cDNA序列。利用同源性比对进行序列分析,通过Northern杂交分析ZmSCL7在不同逆境胁迫下的表达特征,对转基因烟草进行Western blot分析,并测定最大光化学效率、叶绿素、丙二醛和脯氨酸含量验证该基因的抗盐功能。【结果】获得ZmSCL7全长cDNA序列1 653 bp,编码550个氨基酸。Northern杂交表明该基因在NaCl、H2O2和低温处理条件下上调表达,在ABA处理条件下下调表达。与对照相比,转ZmSCL7烟草在200 mmol.L-1NaCl时萌发受到较小抑制,且最大光化学效率、叶绿素和脯氨酸含量上升,丙二醛含量下降。【结论】ZmSCL7作为一个转录因子受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了烟草的抗盐性。

水稻叶鞘原生质体转化体系的构建及Pik-H4和AvrPik-H4蛋白的瞬时表达

【目的】探索水稻叶鞘原生质体最佳游离时间以及转化时间,提高瞬时表达效率,在蛋白水平对目的基因进行检测且大批量表达。探索该系统表达抗稻瘟病蛋白Pik1-H4、Pik2-H4及无毒蛋白Avr Pik-H4的可行性,对目的基因的功能进行分析。【方法】以高抗稻瘟病品种H4及对照品种中二软占作为试验材料,利用1/2 MS培养基种植水稻幼苗25℃恒温培养7—10 d。利用纤维素酶及离析酶对水稻叶鞘进行酶解,血球计数板分别统计游离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h的细胞数目获得最佳的酶解时间。将目标基因Pik1-H4、Pik2-H4及Avr Pik-H4分别与GFP融合,构建瞬时表达载体,利用PEG介导转入水稻叶鞘原生质体。设置转化10、12、14、16、18、20、22和24 h,分别提取细胞总RNA,UBQ管家基因为对照,设计GFP特异性扩增引物,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测GFP的相对表达量,探索最佳的转化时间。通过激光共聚焦扫描显微镜对目标基因进行亚细胞定位观察,推测基因功能。提取细胞总蛋白,以Anti-GFP为一抗用Western blot对目标蛋白表达进行验证。【结果】相对室温土壤栽培,营养丰富且均衡的1/2 MS培养基恒温种植的水稻幼苗质量更优质,活力更高。游离时间的长短对游离效率影响较大,游离的最佳时间为4—6 h,在3—4 h细胞游离数目增长速度最快,4—6 h细胞数量趋于平稳,6 h以后细胞总量呈现下降趋势,特别是7 h以后,显微下细胞碎片增多,细胞死亡速度加快。检测GFP的相对表达量,获得最佳转化时间为14—16 h,16 h达到最高值,之后逐渐下降。随着时间的推移,荧光显微镜下观察到GFP蛋白发出的荧光逐渐淬灭。亚细胞定位观察发现Avr Pik-H4蛋白主要被定位于水稻细胞膜上,初步推测是一种膜蛋白,通过某种形式运输到宿主细胞作为激发子触发一系列反应。Pik-H4是高效广谱抗稻瘟病基因,分为Pik1-H4和Pik2-H4两个部分,Pik1-H4主要定位在内质网,Pik2-H4主要定位在质体,从定位结果初步推定Pik1-H4可能主要参与Avr Pik-H4蛋白的识别反应,Pik2-H4主要起到调控下游抗病的作用。Western blot结果显示目标蛋白表达成功,分子大小正确。Pik1-H4和Avr Pik-H4的表达量高于Pik2-H4,说明分子量的大小不是影响转化效率的关键因素。【结论】水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统具有高效快速的特点,通过对游离及转化时间的探索为水稻瞬时表达体系的广泛实践应用提供参考。目标基因的成功表达为Pik-H4与无毒蛋白互作机制的研究提供了有价值的理论依据。

丙丁酚抑制氧化型低密度脂蛋白诱导系膜细胞转化生长因子-β_1表达

目的 观察丙丁酚对ox- LDL诱导系膜细胞AP -1活性和TGF -β1 表达的作用 ,探讨抗氧化剂治疗脂质肾损伤的分子机制。方法 大鼠系膜细胞随机分为正常细胞组、ox- LDL处理组和ox- LDL +丙丁酚处理组。运用凝胶迁移率实验检测AP-1活性变化 ,Western杂交检测c- Jun、JNK/SAPK磷酸化及TGF- β1 蛋白表达水平的改变。运用Northern杂交检测TGF- β1- mRNA表达。结果 丙丁酚 5 0 μmol/L预处理系膜细胞 2 0h ,显著降低ox LDL诱导系膜细胞AP 1活性。丙丁酚浓度为 5 0、1 0 0、2 0 0 μmol/L时 ,均显著抑制ox- LDL诱导JNK ,/SAPK磷酸化 ;且ox LDL +丙丁酚处理组的c Jun蛋白表达分别为ox- LDL处理组的 6 0 %、5 1 %和 4 6 %。Northern杂交显示 :ox LDL为 1 0 μg/mL时并不激活TGF- β1 mRNA表达 (P >0 .0 5 ) ;而当ox-LDL浓度增至 5 0、1 0 0 μg/mL时 ,TGF -β1 mRNA表达分别增加 1 .8和 1 .9倍。Western杂交显示ox -LDL呈剂量依赖方式增加TGF β1 蛋白质表达。加入丙丁酚后显著降低ox LDL诱导系膜细胞的TGF -β1- mRNA和蛋白质表达 (P <0 .0 5 )。结论 丙丁酚可能通过抑制JNK1 /SAPK磷酸化和AP 活性下调ox- LDL诱导系膜细胞TGF- β1 表达。

HepG2细胞构成的生物人工肝脏体外氨与安定的代谢能力

目的:为增强HepG2细胞的氨和苯二氮(?)类代谢活性, 在Enosawa et al的HepG2-GS细胞基础上以转基因技术,建立一种谷氨酰胺合成酶(glutamine sythetase,GS) 和细胞色素P450 3A4(CYP 3A4)都过表达的HepG2- GS-3A4细胞.并在人工肝脏循环器中培养此细胞,以检测此人工肝脏的氨和安定(Diazapam,DZP)的代谢率. 方法:以Western杂交和免疫组化等方法证实CYP 3A4 蛋白过表达后,将HepG2-GS-3A4细胞接种于一种人工肝脏循环器,待细胞数量增至足够后,充入含NH4Cl和安定的培养液,孵育24 h,定时取样,分别以Berthelot反应法检测氨浓度,以HPLC法检测DZP 及其代谢产物. 结果:CYP 3A4蛋白在HepG2-GS-3A4细胞中表达显著强于HepG2细胞(P=0.02).在接种有HepG2-GS- 3A4细胞的生物人工肝脏循环器中与HepG2细胞和无细胞组相比,氨浓度明显降低(P=0.04),氨浓度约降低约31.7%;DZP浓度也明显降低(P=0.03),且有DZP 的代谢产物生成产生,DZP浓度约降低36.7%. 结论:接种有HepG2-GS-3A4细胞的生物人工肝脏有明显的DZP和氨的代谢能力,代谢能力虽弱于文献中的猪原代肝细胞,但具有性质稳定,易于传代和储存,获取细胞数量不受限制等优点.

灵芝lz8基因的克隆和原核表达及LZ-8蛋白的免疫印迹检测

根据已报道的lz8基因序列设计引物,以灵芝基因组DNA为模板,PCR扩增获得lz8基因。构建了原核表达载体pET30a-lz8,转化原核表达宿主菌RosettaDE3,IPTG诱导融合蛋白表达,并用Ni-NTA亲和层析柱对LZ-8蛋白进行分离纯化。将纯化的LZ-8蛋白用Freund佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内,经数次加强免疫后采血分离抗血清,并以抗血清为探针建立了LZ-8蛋白的免疫印迹法定性检测方法。

前β_1-HDL的纯化与鉴定

为进一步研究前 β1 - HDL 的结构和生理功能 ,以改良低温乙醇法制备的人血浆 HDL 制剂为原料 ,采用超速离心、分子筛层析以及亲合层析技术分离纯化前 β1 - HDL。结果 :制备的脂蛋白颗粒经免疫双扩散、SDS-PAGE、免疫电泳、Western杂交试验及组成分析确定其为前 β1 - HDL,并且与家兔肝细胞膜 HDL 受体有高亲和性结合。

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照 h BDNF基因全长编码序列设计合成引物 ,从人基因组 DNA中扩增出 76 0 bp的片段 ,反向插入到 p GEM- 3Zf(+ )载体上 ,获得 p GEMBF18克隆 ,限制性酶分析和 DNA序列测定均证实该克隆插入片段为h BDNF基因全长编码序列。从 p GEMBF18克隆中获取 h BDNF全长编码片段 ,与原核表达载体 p GEX- 5 T连接 ,构建了 p5 TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌 JM10 9,经 IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE特异区带分子量为 43k Da,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的 7.5 3% ,Western杂交证实该特异区带具 h

人类T型钙通道α_(1G)和α_(1H)亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切，然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究。利用过量表达人类T型钙通道α_(1G)和α_(1H)亚单位基因(CACNA1G和CACNA1H)的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用，通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_(1G)和α_(1H)亚单位基因的过量表达；从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间，HEKα_(1G)^+细胞为(13．7±0．3)h，HEKα_(1H)^+细胞为(14．0±O．4)h，都短于对照HEK-293细胞的(22．1±1．1)h，流式细胞分析结果表明，在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高，相反地处于G_1期的百分率比对照HEK-293细胞低。结果表明，T型钙通道α_(1G)和α_(1H)亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖，这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradiL抑制，Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质(CDK2，cyclinA和cyclinE)的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖。

特发性脊柱侧凸椎旁肌组织bcl-2等蛋白表达及细胞凋亡的研究

目的本研究通过比较脊柱侧凸患者胸弯顶点处凸侧、凹侧椎旁肌的bcl-2、Caspase-3及bcl-x表达的差异,以从分子生物学角度探讨椎旁肌在脊柱侧凸中可能的作用机制。方法选择2001年8月至2001年12月间于我院收治的胸椎侧凸畸形患者10例,采用免疫组织化学和Western杂交检测脊柱侧凸凸侧、凹侧椎旁肌组织中bcl-2、Caspase-3及bcl-x基因的表达,采用HE染色和SA染色检测椎旁肌组织肌纤维形态,TUNEL原位检测椎旁肌肌细胞的凋亡情况。结果脊柱侧凸患者凸侧肌肉组织bcl-2、Caspase-3及bcl-x蛋白的表达量均降低,以bcl-2降低最为明显。脊柱侧凸患者及正常对照椎旁肌肉组织均存在个别细胞的凋亡,二者无明显差异。凸侧肌纤维比其凹侧及正常对照的肌纤维明显变细。结论神经-肌肉异常所致的椎旁肌的不对称有可能是特发性脊柱侧凸发生发展的一个重要因素,而这种不对称很可能与bcl-2、Caspase-3及bcl-x的表达不对称相关。

鸭乙型肝炎病毒表面抗原的纯化及应用

目的：从鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染鸭血清中纯化表面抗原（DHBsAg），初步应用于病毒感染后复制的研究。 方法：用蔗糖密度梯度离心纯化病毒表面抗原，经Bradford法定量血清中该蛋白含量； 建立DHBsAg ELISA检测方法， 并与DHBV DNA斑点杂交相比较。 结果：纯化DHBsAg 经ELISA检测OD490nm≥1.0，Western杂交显示主要肽分子量为17KDa和35KDa；Bradford法定量血清蛋白含量为2.85～5.10μg/ml, DHBsAg ELISA检测100份血清标本阳性数为84例, 斑点杂交检测阳性数为88例,两者吻合率为94%。 结论：DHBsAg 的制备及ELISA方法的建立，为进一步研究病毒感染后复制及体内免疫应答状况奠定了基础。

ARIP1,2 mRNA及其蛋白在小鼠脑组织表达和分布的比较研究

目的比较新发现的激活素受体相互作用蛋白1,2(ARIP1,2)在小鼠脑组织的表达与分布。方法采用Northern杂交检测ARIP1,2 mRNA,Western杂交及免疫组化染色检测ARIP1,2蛋白。结果Northern杂交显示ARIP1,2 mRNA在小鼠组织中的表达形式明显不同,ARIP1主要在脑组织表达,ARIP2组织表达广泛。Western杂交进一步揭示ARIP1在大脑、小脑、海马、下丘脑及垂体表达,而ARIP2在大脑、小脑、海马、下丘脑、垂体及脾脏均有不同程度表达。免疫组化染色显示,ARIP1,2成熟蛋白在大脑、小脑及垂体均有表达,ARIP1在大脑和小脑皮质主要表达在小细胞神经元,而ARIP2主要表达在大细胞神经元。ARIP1在神经垂体和腺垂体表达水平明显高于ARIP2。结论ARIP1,2均表达于脑和垂体,但其表达的细胞类型和强度明显不同,这种差异可能与其在神经细胞中介导激活素生物学活性差异有关。

RSSG58基因在水稻精细胞中的表达

RSSG5 8是利用抑制差减杂交技术从水稻精细胞文库中筛选到的在精细胞中优势表达的基因 ,推测其编码的蛋白质与拟南芥的肌球重链蛋白有一定的同源性 (4 6 % ) ,并具有肌球蛋白特色的结构域。把RSSG5 8基因开放编码框连接到表达载体pQE30上 ,重组质粒在E .coliM15中表达出N端融合了 6×His的融合蛋白。SDS PAGE分析表明 ,表达产物的分子量约为 6 6kD ,其表达量占菌体总蛋白的 8.6 %。分离纯化融合蛋白来免疫家兔 ,制得了高效价、高特异性的多克隆抗体。Western杂交显示 ,在分离的精细胞内该基因编码的蛋白表达量很高 ,而成熟花粉和二细胞中只有微弱表达 ,单细胞花粉、花粉母细胞没有杂交信号 ,表明RSSG5 8基因在精细胞中优势表达。

鸡胚脊髓背角感觉神经元诱向因子的初步分离及鉴定

为探讨脊髓背角内影响SG神经元存活和生长的因素，取500只Hamburger40期鸡胚脊髓背角组织匀浆，离心后提取上清液，用SDS－PAGE电泳初步分离脊髓背角内的蛋白质。以简易细胞钓蛋白带（PBFC）技术找寻有神经细胞贴附的蛋白带并求相对迁移率（Rf）。将有神经细胞贴附的各Rf范围凝胶剪下并将胶内各蛋白带电转移至硝酸纤维膜上，用NGF、BDNF、NT－3、GDNF兔抗血清于硝酸纤维膜上分别进行Western杂交。PBFC结果显示：在电泳胶Rf0．10～0．19、0．30～0．35、0．50～0．55、0．60～0．67、0．90～0．94处发现有多少不等的神经元附着。而Western杂交结果表明，在上述各Rf范围均有强弱不等的多条阳性杂交带。分别为NGF、BDNF、GDNF者；NGF、BDNF、NT－3者；NGF、BDNF、NT－3者；NGF、NT－3者、BDNF、NT－3者。提示：40期鸡胚脊髓背角提取液各Rf蛋白带的促神经元存活作用，至少涉及NGF、BDNF、NT－3、GDNF中的两种或三种。