传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。

黄瓜黄叶基因YL的精细定位及候选基因预测

以黄瓜自交系WD_(1)为材料,采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变方式获得了一个稳定遗传的黄叶突变体yl;以黄叶突变体yl为父本、黄瓜自交系S52为母本,构建F_(2)群体,并对黄叶突变体yl、S52、F_(1)和277株F_(2)群体的叶色性状进行调查和遗传分析。结果表明:该突变体受一个隐性核基因控制,且绿色叶对黄色叶为完全显性。利用黄瓜7条染色体上的235对SSR引物对F_(2)群体的野生型与突变体DNA池进行混合分组分析法(BSA)分析,筛选得到2个DNA池间多态性标记5对,初步将该基因定位在黄瓜4号染色体分子标记SSR15682和SSR05415之间。通过进一步开发和筛选亲本间多态性分子标记,利用277株F_(2)群体将YL基因定位于黄瓜4号染色体上的分子标记In Del4-9和In Del4-10之间,物理距离为936.39 kb。利用20株黄化苗DNA混池基因组重测序数据和课题组已有的黄瓜自交系WD_(1)、S52重测序数据以及黄瓜9930基因组数据,对定位区间内基因进行序列分析,推测Csa4G297530为候选基因。

杜撒×大长撒VRTN基因多态及其与生产性状的关联研究

为研究杜撒×大长撒VRTN基因多态及其对育肥、胴体、肉质的影响。采用PCR直接测序法对杜撒×大长撒、杜洛克、长白、大白VRTN基因启动子区和4个外显子区进行单核苷酸多态性检测,计算VRTN基因多态位点基因型频率及基因频率,测定杜撒×大长撒猪群的育肥、胴体和肌肉品质,采用最小二乘模型分析VRTN基因与育肥、胴体、肉质的关联。结果显示:在4个猪群中共检测到VRTN g.97615896_97615897ins291和VRTN g.97622607G>A 2个突变位点具有多态性,其中,g.97615896_97615897ins291在4个猪群中均存在Q/Q、Q/Wt、Wt/Wt 3种基因型,4个群体均属于中度多态,均处于Hardy-Weinberg平衡状态;杜撒×大长撒g.97615896_97615897ins291位点Q/Q基因型活体背膘厚比Wt/Wt基因型少0.36 mm(P<0.05)、肋骨数比Wt/Wt基因型多0.63对(P<0.01),Q/Wt基因型胴体斜长比Wt/Wt长1.56 cm(P<0.05),Q/Q和Q/Wt基因型眼肌面积比Wt/Wt多4.38 cm^(2)、4.34 cm^(2)(P<0.05),Q/Q基因型瘦肉率比Wt/Wt高3.23百分点(P<0.05)、脂率比Wt/Wt低4.1百分点(P<0.05);VRTN g.97622607G>A位点在杜撒×大长撒属于低度多态(PIC=0.0799),处于Hardy-Weinberg平衡状态;杜撒×大长撒VRTN g.97622607G>A位点GG基因型30~100 kg日增重比GA基因型多61.43 g·d^(-1)(P<0.01),瘦肉率比GA基因型高2.53百分点(P<0.05)。结果表明:VRTN g.97615896_97615897ins291位点插入等位基因Q可增加杜撒×大长撒猪群肋骨数、胴体斜长、眼肌面积和瘦肉率,降低活体背膘厚和脂率;VRTN g.97622607G>A位点GG基因型可提高杜撒×大长撒猪群的日增重和瘦肉率。本研究结果为利用VRTN基因进行分子标记辅助选择提高撒坝猪的生产性能提供依据。

杜仲法尼烯基焦磷酸合酶基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR法,从杜仲幼嫩叶片中分离法尼烯基焦磷酸基因c DNA全长序列,克隆并对该基因全长序列进行生物信息学分析。从杜仲嫩叶中共获得两个基因分别命名为Eu FPPs1和Eu FPPs2,测序结果表明两基因开放阅读框分别为1 047 bp和1 029 bp,推测分别可以编码348个和342个氨基酸残基,在线预测表明两个蛋白序列均存在两个聚丙烯合酶位点。系统进化分析结果表明,Eu FPPs1和Eu FPPs2分别聚集于不同的分支,它们之间的进化距离为0.352,但是在亲缘关系上均与楤木和人参最近,进化距离分别为0.281、0.287,0.175、0.184。

柔嫩艾美耳球虫杨陵株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。

柔嫩艾美耳球虫杨凌株SO7基因的克隆表达与保护性试验

【目的】克隆鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因并进行原核表达,检测表达产物的免疫原性,为鸡球虫基因疫苗的制备奠定基础。【方法】以纯化的柔嫩艾美耳球虫杨凌(Eimeria tenella YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的SO7基因,对其测序后进行序列分析。将SO7基因克隆到表达载体pET-32a中,构建pET-SO7重组质粒,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,评价其免疫效果。【结果】鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因序列的开放阅读框(ORF)为651个碱基,共编码217个氨基酸。E.tenella YL株SO7基因与E.tenella LS18株、E.tenella BJ株、E.tenella GD株SO7基因ORF区序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%,其氨基酸序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%。SDS-PAGE分析表明,表达产物成功地表达出了分子质量为45ku的融合蛋白。各种抗球虫指标的测定结果显示,该蛋白对球虫感染鸡体具有一定的保护性。【结论】SO7基因具有很强的保守性,各虫株之间差异不大;重组蛋白具有一定的保护效果,适合用来制备基因疫苗。

柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的克隆表达及免疫保护性研究

【目的】对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌株RB1-a基因进行克隆与表达,检测表达产物的免疫保护性,为鸡球虫基因工程疫苗的研制奠定基础。【方法】以纯化的E.tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出其RB1-a基因,测序后进行序列分析。然后将RB1-a基因N端不含信号肽序列克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-RB1-a重组质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,对其免疫效果进行评价。【结果】柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的开放阅读框(ORF)包含618个碱基,编码205个氨基酸,与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。SDS-PAGE分析表明,重组质粒表达分子质量为42ku的融合蛋白。免疫效果测定结果显示,RB1-a免疫组和RB1-a+佐剂免疫组的相对增重率分别为64.2%和69.4%,卵囊减少率分别达37.22%和30.56%,抗球虫指数分别为146.2和150.4。【结论】RB1-a基因具有很强的保守性,种间差异不大;RB1-a重组蛋白具有一定的免疫保护效果。

杜撒♂×大长撒♀F_(1)代猪ARHGEF37基因多态性及其对生长性状的影响

【目的】揭示ARHGEF37基因多态性及其对猪生长性状的影响,为利用该基因标记推进滇撒猪配套系的进一步选育及开发利用提供参考依据。【方法】以274头杜撒♂×大长撒♀F;代猪为试验材料,采用PCR扩增产物直接测序法检测ARHGEF37基因外显子8多态性,采用最小二乘模型分析各SNP位点基因型及单倍型组合对5个生长性状的影响。【结果】在杜撒♂×大长撒♀F;代猪ARHGEF37基因外显子8上检测出C1262G、T1293C、G1395A和C1398T 4个SNPs位点,分别以CC、TT、GA、CC基因型、等位基因C、T、G、C及单倍型CTGC的频率最高;除T1293C位点外,其余各位点的杂合度在0.4552~0.4940,遗传多样性较丰富。C1262G位点GG基因型个体达100 kg体重日龄(258.93±2.95 d)显著高于CG基因型个体(249.87±2.68 d)(P<0.05,下同),CG基因型个体30~60 kg日增重(462.44±15.44 g)显著高于CC基因型个体(409.29±14.30 g);T1293C位点TT基因型个体30~60 kg日增重(445.04±9.70 g)极显著高于TC基因型个体(329.33±42.26 g)(P<0.01),TT基因型个体30~100 kg日增重(516.96±6.44 g)显著高于TC基因型和CC基因型个体(470.92±28.08 g和480.64±16.94 g)。此外,达60 kg体重日龄和达100 kg体重日龄均以CTGC/GTGC组合最短(161.84±5.07 d和241.00±5.11 d),CTGC/CCGC组合最长(188.80±11.33 d和272.60±11.42 d);30~60 kg日增重和30~100 kg日增重分别以CTGC/GTAT组合和CTGC/GTGC组合最高(479.56±20.66 g和545.42±19.76 g),均以CTAC/CCGC组合最低(275.00±84.33 g和437.00±55.88 g)。【结论】ARHGEF37基因的G1395A和C1398T位点的遗传多样性较丰富;C1262G位点的CG基因型、T1293C位点的TT基因型及CTGC/GTGC单倍型组合对杜撒♂×大长撒♀F;代生长性状的影响较大,携带有CTGC单倍型个体的各生长性状均处于较高水平。

S-三甲基-L-半胱氨酸对膀胱尿路上皮癌细胞Eg5基因表达和凋亡的影响

目的:体外观察纺锤体驱动蛋白Eg5抑制剂S-三甲基-L-半胱氨酸(STLC)对人膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞Eg5基因表达和凋亡的影响。方法:分别采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)比色法、TUNEL染色法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting法检测STLC对人膀胱癌BIU-87细胞的细胞周期、生长抑制率、凋亡指数、Eg5 mRNA及其蛋白相对表达水平的影响。结果:将STLC与BIU-87细胞共孵育,不同时间点收集细胞,可见随着STLC作用时间延长至16 h,细胞有丝分裂周期中G2/M期的BIU-87细胞明显增多(29.6%),且细胞发生凋亡的比例也有明显增加的趋势。统计分析显示,与0 h相比,STLC处理16 h时细胞凋亡比例升高,差异有统计学意义(P=0.020)。去除STLC后再培养,于不同时间点收集细胞,结果表明STLC去除后BIU-87细胞周期进程开始恢复,与去除1 h时G2/M期细胞比例(34.84%)相比,去除3 h后G2/M期细胞比例(24.9%)显著降低,差异有统计学意义(P=0.001);细胞凋亡比例差异也有统计学意义(P=0.049)。与对照组相比,STLC处理组细胞增殖抑制率和凋亡指数均显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);与对照组相比,STLC处理组Eg5 mRNA和蛋白的表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:STLC可有效抑制Eg5基因表达并诱导人膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞凋亡,为膀胱尿路上皮癌的药物治疗提供了实验依据和理论基础。

TSPO介导YL-IPA08抗创伤后应激障碍作用的药理学研究

目的利用基因敲除动物研究18ku转位蛋白(TSPO)在YL-IPA08抗创伤后应激障碍(PTSD)中的作用并探讨其潜在药理学靶标价值。方法采用PCR法对TSPO野生型(WT)和敲除型(KO)小鼠进行基因分型鉴定。采用公认的小鼠足底电击PTSD模型,以开场实验评价小鼠自发活动,以僵住时间检测评价小鼠PTSD样恐惧行为。结果基因型鉴定证实,与TSPO WT小鼠相比,TSPO KO小鼠不含完整可表达的TSPO基因,且TSPO敲除不影响小鼠的自发活动。PTSD模型建立(第-1天~第0天)后第1、5、16天,模型组小鼠的僵住时间显著增加,TSPO敲除不影响模型小鼠的这一改变;模型建立后连续8 d(第0天~第7天)灌胃给予TSPO选择性激活剂YL-IPA08(0.3 mg/kg,1次/d)或阳性药舍曲林(15 mg/kg,1次/d)可显著降低WT模型小鼠的僵住时间,表现出显著的抗PTSD作用,而在KO小鼠上无此作用。结论首次发现TSPO WT与KO小鼠在PTSD模型中表现出相同的敏感性(即PTSD样行为表型相同),但TSPO介导了YL-IPA08的抗PTSD作用。该研究为TSPO的潜在药理学靶标价值提供了直接证据。

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。