欧洲葡萄NF-YB3基因克隆与表达分析

为探究VvNF-YB3基因在葡萄生长发育和响应非生物胁迫过程中的功能,以无核白为试材,克隆得到了VvNF-YB3基因编码区序列,全长为624 bp,编码207个氨基酸,蛋白质等电点6.31,不稳定指数27.66,总平均疏水指数-0.738,为一酸性、稳定的亲水蛋白。通过生物信息学分析发现,VvNF-YB3基因位于10号染色体,含有1个内含子,编码蛋白质存在1个CBFD_NFYB_HMF结构域,与河岸葡萄NF-YB3相似性最高。VvNF-YB3的二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比较高,三级结构为单体的螺旋-卷曲-螺旋,启动子中包含响应激素和胁迫的多个顺式作用元件。VvNF-YB3基因在葡萄的叶片、卷须、花、幼果和茎中均表达,且在成熟的叶片中表达量最高。PEG模拟的干旱、低温和高温胁迫均可影响VvNF-YB3基因的表达,VvNF-YB3为一胁迫响应基因。VvNF-YB3的互作蛋白大多是核因子Y家族的亚基,ERF、bHLH、ARF等27个转录因子可能调控VvNF-YB3基因的表达。由此推测,VvNF-YB3基因可能通过受到上游转录因子的调控并与其他NF-Y蛋白互作响应各种环境胁迫。

合作猪SIRT 3基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆合作猪沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,SIRT3)基因CDS区序列,并对其进行生物信息学分析,探究SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达水平,为研究SIRT 3基因功能奠定基础。【方法】试验选择3月龄合作猪公猪3头,采集心脏、睾丸、肺脏等组织,采用PCR扩增、Sanger测序等方法获取SIRT 3基因CDS区序列,并通过Mega 7.0软件构建系统进化树;通过生物信息学在线软件分析SIRT3蛋白结构和功能;采用实时荧光定量PCR检测SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达量。【结果】合作猪SIRT 3基因CDS区长774 bp,共编码257个氨基酸。系统进化树结果显示,合作猪与家猪亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。SIRT3蛋白的分子质量为28.68 ku,理论等电点为5.81,不稳定系数为37.92,为稳定性亲水蛋白;该蛋白不存在跨膜区域,无信号肽,但存在2个低复杂度结构域,主要分布于内质网中;SIRT3蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构模型预测结果与二级结构基本一致。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT 3基因在合作猪不同组织中均有表达,在心脏中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),其次是睾丸、肺脏、肝脏组织。【结论】本研究成功克隆合作猪SIRT 3基因CDS区序列,探究了SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达水平并初步分析了其编码蛋白的生物学功能,为进一步研究合作猪SIRT 3基因功能提供了参考。

鸡皮刺螨羧酸酯酶2基因克隆、序列分析及其表达特征研究

【目的】克隆鸡皮刺螨(Dermanyssus gallinae)羧酸酯酶2(CarE2)基因CDS区序列并进行生物信息学分析,同时检测其在鸡皮刺螨中的表达特征,以探究CarE2基因在鸡皮刺螨代谢抗性形成及发展中的作用。【方法】试验选择50只成年鸡皮刺螨雌螨,利用PCR扩增CarE2基因CDS区序列并测序,对其编码氨基酸序列进行多序列比对及系统进化树构建,通过生物信息学在线软件预测CarE2蛋白的理化性质及结构功能,并采用实时荧光定量PCR检测CarE2基因在鸡皮刺螨不同发育阶段及不同抗性品系中的表达模式,同时分析高效氯氰菊酯对鸡皮刺螨敏感品系和高效氯氰菊酯抗性品系中CarE2基因的诱导效应。【结果】鸡皮刺螨CarE2基因CDS区序列全长1665 bp,编码554个氨基酸。多序列比对结果显示,CarE2基因氨基酸序列具有高度保守的催化三联体(Ser-Glu-His)和五肽基序(Gly-X-Ser-X-Gly)。系统进化树结果表明,鸡皮刺螨CarE2与黑腹果蝇亲缘关系相近,共同划分为表皮酯酶分支。生物信息学分析结果显示,CarE2蛋白属于稳定的亲水蛋白,存在信号肽切割位点,且具有糖基化位点和多个磷酸化修饰位点,但不具有跨膜结构;CarE2蛋白二级结构以无规则卷曲为主,三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR检测结果显示,CarE2基因在鸡皮刺螨若螨时期表达量最高,显著高于其他时期(P<0.05),成螨期表达量次之,在卵和幼螨时期的表达量相对较低;鸡皮刺螨高效氯氰菊酯抗性品系中CarE2基因的相对表达量是敏感品系的2.78倍;经高效氯氰菊酯胁迫处理后,鸡皮刺螨敏感品系中CarE2基因表达量与对照组相比差异不显著(P>0.05),而高效氯氰菊酯抗性品系中CarE2基因表达量与对照组相比显著升高(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆鸡皮刺螨CarE2基因CDS区序列,其在鸡皮刺螨各发育阶段均有表达,且在高效氯氰菊酯抗性品系中过量表达。经高效氯氰菊酯处理后CarE2基因表达量显著上调,推测CarE2基因参与鸡皮刺螨对高效氯氰菊酯的羧酸酯酶解毒代谢抗性。

滇水金凤耐铜相关基因CAX3和CCS的克隆及表达分析

植物CAX(Ca2+/H+反向转运蛋白)和CCS(铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白)分别是重要的液泡膜转运蛋白和铜伴侣蛋白,通过不同机制在缓解重金属胁迫中发挥着重要作用。本课题组前期研究发现滇水金凤(Impatiens uliginosa)对铜胁迫具有很好的耐受性,并通过转录组测序筛选出耐铜相关基因。在此基础上,本研究以野生滇水金凤为材料,通过RT-PCR技术克隆获得耐铜相关基因CAX3和CCS,分别命名为IuCAX3和IuCCS,其cDNA序列长度分别为1320 bp和975 bp,分别编码439个和324个氨基酸。生物信息学分析结果表明,IuCAX3为不稳定蛋白,具有caca2超家族的保守结构域,定位在质膜、液泡上;IuCCS为稳定蛋白,具有PLN02957超家族的保守结构域,定位在叶绿体上。系统进化分析结果显示,IuCAX3和IuCCS均与喜马拉雅凤仙花的相应基因聚为一支,相似性分别为98.18%和89.81%。通过设置不同的铜处理浓度(0、5、10、15、20、25 mg·L^(-1))研究了IuCAX3和IuCCS基因在滇水金凤叶片中的表达情况,qRT-PCR分析结果表明,铜处理能诱导两个基因大幅上调表达,且铜浓度为15 mg·L^(-1)时的上调幅度最大,并均在处理12 d达到最高水平;随处理时间延长,IuCAX3的表达量先升高后降低,IuCCS的表达量在铜浓度不高于15 mg·L^(-1)时呈先升后降再升的趋势,但当铜浓度高于15 mg·L^(-1)后则呈先升后降的趋势,而且铜处理下IuCCS的表达水平明显高于IuCAX3,因此推测IuCAX3基因主要在铜胁迫前期起作用,而IuCCS基因在铜胁迫后期仍发挥重要作用。本研究结果可为深入研究滇水金凤耐铜分子机制提供一定的参考依据。

三种花色黄芩中F3′5′H基因的克隆及表达分析

类黄酮3′,5′-羟化酶(flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是花青素合成途径中催化形成蓝色飞燕草素的关键酶。本研究通过RT-PCR方法,从蓝紫花、玫红花、白花黄芩中克隆得到F3′5′H基因的全长序列,分别命名为SbF3′5′H-b、SbF3′5′H-r、SbF3′5′H-w。经序列比对,SbF3′5′H-r基因较SbF3′5′H-b/w缺失7 bp,导致蛋白翻译提前终止。生物信息学分析显示,三个SbF3′5′H蛋白均属于细胞色素P450家族,定位在内质网。SbF3′5′H-B/W蛋白具有典型的CYP450保守序列,包括富含脯氨酸基序“LPPGP”、底物识别位点SRS1~6、折叠锁定基序“E××R”、血红素结合基序“PFGAGRRICAG”及预测的羟化活性位点CR1和CR2。而SbF3′5′H-R蛋白由于序列缺失影响二级、三级结构,并导致CYP450结构域不完整,C端缺少多个维持酶活性的保守基序。基于F3′5′H蛋白序列的系统进化分析结果显示,黄芩与同为唇形科的丹参、一串红等亲缘关系最近,聚在一个分支,与单子叶植物亲缘关系较远。基因表达分析结果显示,SbF3′5′H在白花中整体表达最高,其次是蓝紫花,玫红花中整体表达最低;不同花发育阶段比较,SbF3′5′H基因均呈现出先升高后降低的趋势,在中蕾期表达量最高,其次是幼蕾期,盛花期表达量最低,蓝紫和白花黄芩不同花发育阶段间差异显著或极显著。本研究结果可为进一步研究不同花色黄芩中SbF3′5′H基因的功能差异、揭示黄芩花色变异的分子机理奠定理论基础。

牦牛TRIB3基因克隆、生物信息学及组织表达差异分析

旨在克隆牦牛毛球族同源蛋白3(TRIB3)基因并进行生物信息学分析,检测其在牦牛各组织中的表达情况,为后续探究该基因在牦牛中的功能提供理论依据。试验采集牦牛乳腺组织并以其cDNA为模板,克隆牦牛TRIB3基因序列,通过生物信息学分析了解其生物学特征和结构,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测TRIB3基因在牦牛心脏、肝脏、肺脏、骨骼肌、乳腺及脂肪组织中的表达情况。结果显示:牦牛TRIB3基因CDS区全长为1074 bp,共编码357个氨基酸,为不稳定性亲水蛋白;同源性对比结果显示,牦牛TRIB3编码氨基酸与野牦牛的同源性最高;系统进化树显示,野牦牛和野牛与牦牛TRIB3基因亲缘关系最近,最远是小鼠;TRIB3蛋白属于不稳定亲水性蛋白,主要存在于细胞核中,不含信号肽和跨膜结构域;TRIB3蛋白二级结构含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,分别占35.85%、9.52%、448%和50.14%;蛋白互作分析结果显示,TRIB3与组成型光形态建成蛋白1(COP1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、CCAAT增强子结合蛋白β(CEBPβ)、激活转录因子3(ATF3)、DNA损伤诱导转录因子3(DDIT3)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)、AKT3和Twist相关蛋白1(TWIST1)之间均有紧密联系。RT-qPCR检测发现TRIB3基因在牦牛的不同组织中均有表达,乳腺组织中的表达量最高。研究结果为进一步探究TRIB3基因在牦牛乳腺中的作用和其生物功能提供一定的理论数据。

燕麦AsSOS1基因克隆及盐胁迫下的表达分析

为探索燕麦主要耐盐基因AsSOS1(Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白)的功能,本研究以耐盐品种青永久195为供试材料,在种子实生苗沙培3周后克隆AsSOS1基因,对其蛋白序列进行同源比对并分析理化性质,预测蛋白的跨膜结构和亲/疏水性以及二级和三级结构,用qRT-PCR分析100 mmol/L NaCl胁迫下AsSOS1基因在燕麦根、茎、叶中的表达。结果表明,AsSOS1的开放阅读框长度为3411 bp,编码1137个氨基酸;AsSOS1蛋白分子量为126.088 KDa,等电点6.62,属于酸性蛋白,稳定系数45.14,疏水性蛋白;AsSOS1蛋白二级结构中包含48.20%的α-螺旋和33.77%的无规则卷曲,三级结构与二级结构预测结果一致,以α-螺旋为主;跨膜结构域预测结果显示,AsSOS1蛋白中包含胞外结构域、跨膜螺旋结构域和胞内结构域,其中氨基酸序列11~424是Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白的保守序列,预测该区域与植物耐盐性相关;进化分析发现,其与硬直黑麦草的亲缘关系最近,相似度高达96%。正常生长条件下,AsSOS1基因在燕麦根、茎、叶中均有表达;在100 mmol/L NaCl胁迫下,AsSOS1基因在茎和根中的表达量分别增加了171.4%和54.1%,说明AsSOS1受盐胁迫诱导,在燕麦耐盐过程中起重要作用。

陆地棉GhUGP1基因的克隆与表达分析

为进一步了解UGPase在棉花中的作用,根据全基因组测序结果,筛选且克隆了在陆地棉纤维发育过程中的关键基因GhUGP1。利用生物信息学方法对其核苷酸和氨基酸序列进行分析,通过同源重组技术,将GhUGP1基因的编码序列构建到原核表达载体pMAL-C4x上,通过IPTG诱导蛋白表达来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件,最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示,GhUGP1(XP_040931642.1)全长序列6572 bp,编码区1404 bp,编码467个氨基酸,预测分子质量约为51.493 ku,等电点为5.86。氨基酸序列比对分析发现在陆地棉、亚洲棉、木槿等不同物种间UGP序列的相似率为90.63%。进化树分析结果显示GhUGP1蛋白与亚洲棉UGP蛋白亲缘关系最近,同源性最高并在一个分支上。亚细胞定位结果显示该蛋白为核膜共定位。蛋白诱导时由于IPTG浓度梯度结果差别不明显,选择IPTG终浓度为0.3 mmol/L,而温度梯度和时间梯度结果差异明显,确定最佳诱导温度为28℃,最佳诱导时间为6 h,蛋白溶解及纯化的温度和时间为28℃诱导6 h。Western Blot结果表明重组蛋白的大小正确,最终成功获得了大小为95.9 ku的pMAL-C4x-GhUGP1重组蛋白,为后期对GhUGP1功能深度解析提供帮助。

广西麻鸡kpna3基因克隆、生物信息学及组织表达分析

为了探究广西麻鸡核转运蛋白α3(karyopherin subunit alpha 3, kpna3)的结构和组织表达谱,试验采集了6只120日龄广西麻鸡的大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、睾丸、肾脏、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌、腹脂、背部皮脂组织,克隆了kpna3基因并进行生物信息学和组织表达谱分析。结果表明:kpna3基因全长1 572 bp,共编码523个氨基酸。kpna3基因序列与原鸡、雉鸡、绿头鸭、鸽、人和小鼠的相似性分别为99.6%、98.3%、95.9%、95.4%、88.1%和88.5%;与原鸡的亲缘关系最近,其次是雉鸡,然后依次绿头鸭和野鸽;kpna3蛋白分子质量为35.86 ku,等电点为9.43,为不稳定的亲水碱性蛋白,不含跨膜结构和信号肽。kpna3基因在广西麻鸡大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、睾丸、肾脏、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌、腹脂、背部皮脂14个组织中均有表达,在肌胃中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。说明成功克隆广西麻鸡kpna3基因的编码区(coding sequence, CDS)序列,在肌胃组织中表达量高可能与基因功能有关。

新疆双峰驼C3d基因cDNA的克隆与序列分析

【目的】克隆骆驼补体C3d基因,分析序列特征,为其佐剂效应研究提供依据。【方法】利用Trizol试剂,从骆驼肝脏组织提取总RNA,并反转录获得cDNA。设计C3d特异引物,应用PCR技术扩增C3d序列,构建到pMD18-T载体。将重组质粒转入感受态菌株并双酶切鉴定。使用ClustW,DNAstar,Swiss-Model软件对构建的重组C3d基因序列进行同源性比对,建立系统进化树并对其二级和三级结构进行预测和分析。【结果】采用骆驼C3d特异引物,PCR扩增获得大小为909 bp的骆驼补体C3d基因。构建至T载体并转入大肠杆菌,获得阳性转化克隆。克隆的新疆双峰驼C3d序列与骆驼科C3d基因之间的同源性在97%以上,与牛和猪C3d基因同源性为88%,与兔和人的C3d基因同源性为83%。对骆驼C3d蛋白采用Swiss-Model软件进行序列分析,预测该蛋白质的二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成,该蛋白可能具有良好的免疫原性和免疫结合活性。【结论】C3d基因在进化中较为保守,在骆驼免疫中可以采用亲缘关系较近的其他动物来源的C3d作为分子佐剂从而增强骆驼免疫效果。

黄连重金属ATP酶基因CcHMA3的克隆和表达分析

目的:克隆黄连重金属ATP酶基因CcHMA3,并对其编码蛋白进行生物信息学以及差异表达分析。方法:根据黄连基因组和转录组数据,利用PCR扩增CcHMA3的全长cDNA并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测CcHMA3基因在黄连植株中的表达差异。结果:克隆获得CcHMA3基因,开放阅读框全长为3030 bp,编码1009个氨基酸;蛋白相对分子量为109.03 kD,理论等电点为6.7;蛋白序列中含有6个跨膜结构域和2个保守结构域,亚细胞定位预测表明CcHMA3位于质膜上,具有一定亲水性。qRT-PCR结果表明,CcHMA3基因在黄连不同组织中的相对表达量由高到低依次为须根、根茎、叶柄、叶片;当镉处理后,CcHMA3基因在须根中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),且对不同镉胁迫处理时间存在明显不同的响应表达。结论:该研究为进一步深入研究CcHMA3基因在黄连重金属镉代谢过程中的调控机制,进而寻找可能的阻断方式奠定了实验基础。

广聚萤叶甲Vg基因的鉴定及表达分析

卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)作为雌性多功能生殖蛋白,为卵黄发生提供所需的储备能源。为明确Vg基因在广聚萤叶甲Ophraella communa生殖过程中的潜在作用,本研究通过RT-PCR技术克隆得到广聚萤叶甲的3个Vg基因,其OcVg1,OcVg2和OcVg3开放阅读框(ORF)分别为5310、5322 bp和5298 bp,对应编码1768、1772和1764个氨基酸。其OcVgs蛋白具有LLTP超家族的保守结构域:LPD_N、DUF1943和VWD结构域;多位于N-端的多聚丝氨酸区(polyserine domains),保守的GL/ICG、R/KXXR/K、DGXR基序和C-端半胱氨酸残基等。构建系统进化树发现,OcVgs与鞘翅目昆虫聚为一支。时空表达分析发现,OcVgs基因在不同组织及发育阶段的表达动态相似,在脂肪体中特异性高表达(P<0.05);在成虫羽化后的性成熟阶段的表达量最高,幼虫期的表达水平可以忽略不计(P<0.05)。研究结果为深入理解广聚萤叶甲生殖作用的分子机制奠定基础。

芜菁黄烷酮3-羟化酶基因的克隆、序列分析及表达

花青素是一类重要的植物次生代谢产物,黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成早期阶段的重要催化酶。利用UV-A处理津田芜菁(Tsuda turnip)和赤丸芜菁(Yurugi Akamaru turnip)块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆了BrF3H基因。津田芜菁和赤丸芜菁的F3H基因完全相同。BrF3H的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrF3H与甘蓝型油菜(Brassica napus)F3H-1的同源性为99%。Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3H表达,基因的表达量与处理时间呈相关。

玉米SQD3基因的克隆、生物信息学及表达模式分析

SQD基因是膜脂中合成硫脂(SQDG)的关键基因,在植物生长发育和光合作用中发挥重要作用。ZmSQD3基因克隆、生物信息学及表达模式分析表明,ZmSQD3基因编码区域中CDS长度为1314 bp,编码437个氨基酸,与ZmSQD3基因亲缘关系最近的是高粱的SQD基因,相似度为92.62%,ZmSQD3基因编码蛋白理论分子量为49.2 kda,等电点为6.85,属不稳定亲水碱性磷酸蛋白,ZmSQD3蛋白被丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化激活从而控制基因的表达,蛋白质二级结构显示Zm SQD3基因编码蛋白中46.00%为α螺旋,14.19%被无规则卷曲占据,β折叠占6.18%,β转角占33.64%。基因表达分析表明,低磷(5μM KH2PO4)胁迫下,无论是根系还是叶片,均呈现出1 d时表达量最低,7 d表达量最高。

3个芹菜品种Agnp-G3PDH基因的克隆及其序列和表达特性分析

从芹菜(Apium graveolens Linn.)品种‘六合黄心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)、‘津南实芹’(‘Jinnan Shiqin’)和‘文图拉’(‘Ventura’)中分别克隆获得非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Agnp-G3PDH。3个品种的AgnpG3PDH基因序列均包含1个全长1 491 bp的开放阅读框(ORF),编码496个氨基酸;存在84个碱基位点差异,导致14个氨基酸位点改变。由该基因编码的‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和‘文图拉’的Agnp-G3PDH蛋白的理论相对分子质量分别为53 201.6、53 051.4和52 960.3,理论等电点分别为pI 7.49、pI 7.86和pI 8.12,氨基酸组成中碱性氨基酸数量大于酸性氨基酸数量;该蛋白质具有亲水性与疏水性双重特性,均为疏水性蛋白。多重比对结果表明:3个品种Agnp-G3PDH基因编码的氨基酸序列同源性达到99.09%,具有高度保守性;且与其他11种植物npG3PDH的氨基酸序列的相似度也较高。在基于np-G3PDH基因编码的氨基酸序列进化树上,3个芹菜品种聚在同一分支中,并与杨柳科(Salicaceae)种类毛果杨(Populus trichocarpa Torr.&Gray)聚在一起,表明它们的np-G3PDH进化关系较近。实时定量PCR分析结果表明:在3个芹菜品种的不同组织中Agnp-G3PDH基因的相对表达水平均有明显差异,其中,在‘津南实芹’的叶、‘文图拉’的花和‘六合黄心芹’的根中该基因的相对表达水平最高;经高温(38℃)、低温(4℃)和干旱(20%PEG)胁迫处理后3个品种Agnp-G3PDH基因的相对表达水平均极显著高于或低于对照,但经盐(0.2 mol·L-1NaCl)胁迫处理后仅品种‘津南实芹’Agnp-G3PDH基因的相对表达水平显著高于对照,品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’Agnp-G3PDH基因的相对表达水平与对照无显著差异。表明该基因的表达具有组织特异性且与品种间的抗逆性差异有关。

桑树花青素合成相关基因MaLAR和MaUGAT的克隆与表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)是催化无色花青素转化为儿茶素的一个关键酶,是植物类黄酮生物合成路径中的一个下游酶,可抑制无色花青素在花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下转化为花青素;花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷⁃2⁃O⁃葡萄糖醛酸转移酶(cyanidin⁃3⁃O⁃glucoside 2⁃O⁃glucuronosyltransferase,UGAT)是植物花青素生物合成路径中一个关键酶,其催化花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷转化为花青素3⁃O⁃(2⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸基)⁃β⁃D⁃葡萄糖苷,使得无色花青素最终转化为稳定的花色苷物质而累积在果实中。通过与川桑(Morus notabilis)基因组数据库进行比对鉴定到了MaLAR和MaUGAT基因,并以粤椹大10与和田白桑的桑椹cDNA为模板克隆了MaLAR和MaUGAT基因。聚类分析结果表明粤椹大10 MaLAR与甜樱桃(Prunus avium)亲缘关系较近,和田白桑MaLAR与川桑亲缘关系较近;粤椹大10 MaUGAT与和田白桑MaUGAT均与川桑亲缘关系较近,均属于蔷薇目。实时荧光定量PCR检测表明MaLAR在和田白桑桑椹S1—S3阶段的表达水平均高于粤椹大10;而MaUGAT则在粤椹大10桑椹S2—S3阶段中表达水平显著高于和田白桑。研究表明MaLAR在桑树花青素合成途径中可能起负调控作用,而MaUGAT在桑树花青素合成途径中可能起正调控作用。

北京长白杂交猪IgGH链基因CH2-CH3的克隆、序列分析及表达质粒构建

根据GenBank中注册的猪IgG H链基因cDNA CH2 CH3序列(SSU03780),设计了含KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从北京长白杂交猪肠系膜淋巴结细胞扩增猪IgG H链基因CH2 CH3序列.将PCR产物纯化回收后,插入到含LacZ基因的克隆载体pGEM-T Easy中,转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆.将所克隆的目的片断亚克隆到原核表达载体pQE 30,构建重组质粒pQE 30/PIgG CH2 CH3.将重组表达质粒转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果表明,本研究克隆了猪IgG H链基因CH2 CH3序列,全长663 bp,编码221个氨基酸,利用Gentyx version 6.0软件将CH2 CH3基因的核苷酸序列与GenBank中的参考序列比较,其核苷酸序列同源率为99.551%,推导的氨基酸序列同源率为100%.将pQE 30/PIgG CH2 CH3转化JM 109感受态细胞,表达的融合蛋白相对分子质量约为26.95 ku,经IPTG诱导2 h,表达量约占菌体总蛋白41.5%.

桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。

伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1000bp片段,扩增产物克隆于pMD18＿T中,双脱氧末端终止法序列测定。通过OM1GA2 0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30 38kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上。将α＿疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域。将该片段插入原核表达载体pGEX＿KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX＿UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS＿PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56kD。

猪圆环病毒3型陕西株Cap基因的克隆、序列分析及原核表达

为了克隆猪圆环病毒3型Cap基因并进行序列分析和原核表达,参考GenBank上已发表的PCV3(KY418606.1)Cap基因序列,合成1对上、下游引物,PCR扩增Cap基因,进行序列分析和原核表达。结果显示,成功克隆到642 bp的Cap基因,核苷酸序列分析显示,PCV3 Cap基因与国内分离株核苷酸同源性最高为95.97%,氨基酸分析显示Cap蛋白不含信号肽和跨膜区。经IPTG诱导后获得了分子质量约35 ku的Cap蛋白,该蛋白能与PCV3阳性血清结合,具备良好的抗原性。成功克隆并原核表达PCV3陕西株Cap基因,为进一步建立PCV3的快速检测方法和研制PCV3亚单位疫苗奠定了基础。