截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论

Bid基因在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的动态变化

目的 探讨Bid基因在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)中的动态变化。方法 通过建立新生大鼠HIBD动物模型 ,采用RT PCR技术检测缺氧缺血后不同时间点缺血侧脑组织中Bid基因表达的变化。结果 正常组中无Bid基因表达 ,缺氧缺血组Bid基因表达明显上调 ,且随着缺氧缺血后时间的延长 ,Bid基因表达呈动态变化缺氧缺血后 6h其表达开始增加 ,2 4h达高峰 ,48～ 72h有所回落。结论 脑缺氧缺血引起的神经细胞凋亡可能与Bid基因表达上调有关。

地塞米松对脑缺氧缺血大鼠bid基因表达及细胞凋亡的影响

目的探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后bid基因表达及细胞凋亡的变化,地塞米松(DEX)对其的调控作用,从而阐明DEX预处理对缺氧缺血新生动物神经保护作用的可能机制。方法7 d龄SD大鼠24只。随机分成DEX组、9 g/L盐水组(NS组)、HIBD组、健康对照组。DEX和NS组在缺血缺氧前12 h腹腔内分别注射DEX、等量NS。通过建立新生大鼠HIBD动物模型,取实验侧大脑半球,采用RT-PCR技术检测脑bid基因表达,采用Tunel法检测凋亡细胞。结果正常组无bid基因表达,HIBD组bid基因表达明显上调,凋亡细胞数明显增加(P<0.01);与HIBD组比较,DEX组bid基因表达明显下调,而凋亡细胞数明显减少(P<0.01)。结论脑缺氧缺血引起神经细胞凋亡可能与bid基因表达明显上调有关。DEX能通过下调bid基因表达,从而抑制细胞凋亡,起到神经保护作用。

缺氧缺血后新生鼠脑Bid基因表达与半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3活性

围产期缺氧缺血性脑损伤（hypoxic—ischemic brain damage，HIBD）后细胞凋亡已得到证实，但其分子学机制尚不十分清楚。Bid基因是一种新的促凋亡基因，国外研究发现Bid基因在神经细胞凋亡中起重要作用，现对新生大鼠缺氧缺血后脑Bid基因表达变化。以及与半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase-3）活性的关系作一探讨。

截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用

目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论

BID蛋白因子诱导脂质体的渗漏和聚集

在大多数真核细胞凋亡中 ,线粒体扮演重要的角色。经一些因子诱导线粒体能释放细胞色素c、诱导凋亡因子 (AIF)等 ,从而引起一系列凋亡酶的激活反应 ,最后导致凋亡。Bcl-2家族蛋白具有调节线粒体释放细胞色素c和其它凋亡因子的作用 ,其中BID ,BAX ,BAK具有促进作用 ,而另一类Bcl-XL 则具有抑制作用。Bcl -2家族蛋白成员含有一些保守的微区称BH1 ,BH2 ,BH3 ,BH4等。BID分子只含有BH3微区。BID经凋亡酶8(Caspase8)处理后成为截短的Bid(truncatedBid,tBid),它能使线粒体明显渗漏或聚集 ,后者可在细胞核周围观察到这一现象。我们前曾报道tBid能诱导单层大脂体 (LUV )内包的胰蛋白酶或细胞色素c释放 ,本文研究并比较Bid ,tBid ,NBid(Bid分子的N端部分 )CBid(Bid分子的C端部分 )以及Bid的突变体 -Bid(D59A)和Bid(G94E)诱导LUVs释出内包的胰蛋白酶。结果表明 ,CBid、Bid和tBid具有相似的效果 ,而NBid ,Bid的两种突变体Bid(D59A)和Bid(G94E)则不能。如果比较上述几种蛋白因子与大豆磷脂脂质体的亲和力 ,其大小与它们诱导脂质体内包的胰蛋白酶泄出的能力相平行 ,即 ,tBid>Bid>Bid(D59A) ,而NBid和Bid(G94E)则几乎不能与脂质体相结合。Bid诱导脂质体的泄漏也与其磷脂组份有密切关系。脂质体中酸性磷脂 (如磷脂酸PA?

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。