内蒙古牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定及其全基因组分析

为确定引起内蒙古地区3月龄~6月龄荷斯坦犊牛暴发呼吸系统疾病的病原,并分析其基因组序列,本研究对病死犊牛剖检并观察其各脏器的剖检病变,制备各组织病理切片,观察其组织病变。结果可见犊牛肺脏呈深红色有光泽的肌肉样实变,心脏肥大,肝脏表面散在细小的结节状灰白色病灶,肾脏表面散在细小深红色出血点;组织病理学观察可见典型间质性肺炎,多数各级细支气管腔和肺泡腔内巨噬细胞和淋巴细胞大量增生和浸润,偶见合胞体细胞,在各级细支气管部分黏膜上皮细胞浆内有大小不等的圆形红染的病毒包涵体;轻度纤维化和小坏死灶的变质性肝炎,急性炎性脾肿,多发性小出血灶的慢性硬化性肾小球肾炎。进一步进行RT-PCR检测,结果显示,扩增获得约600 bp的目的条带,测序后与GenBank中相关基因序列比对,结果显示目的基因与牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)美国分离株USII/S1(KU159366)的同源性最高(98.42%),表明该地区某牧场犊牛感染了BRSV。将该病例肺组织研磨上清液接种牛肾细胞(MDBK)盲传3代出现典型的细胞病变,经RT-PCR检测确认为BRSV,进一步表明分离到1株BRSV,命名为IM BRSV-39。分段扩增IM BRSV-39株的全基因组序列,经测序后拼接获得长度为15130 bp的BRSV全基因组序列。采用MegAlign软件分析IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因序列和F基因序列的同源性及突变位点;采用MEGA 11软件构建分离株全基因组进化树分析其遗传进化关系。结果显示,IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因和F基因序列均与BRSVⅢ亚型分离株相应基因序列的同源性最高、且位于同一进化分支,证实IM BRSV-39株属于BRSVⅢ亚型;突变位点分析结果显示:与BRSVⅢ亚型参考株相比,IM BRSV-39株G基因序列存在7个突变位点,F基因序列存在12个突变位点;G蛋白氨基酸序列存在4个突变位点,其中L13H处在G蛋白的胞质结构域(aa1~aa37);Y^(127)H、I^(139)T、P^(177)L、A^(186)T处在G蛋白的胞外结构域(aa66~aa257);F蛋白氨基酸序列存在5个氨基酸突变位点,其中M^(4)T、M^(7)T、S^(14)C处在F蛋白氨基末端信号肽区(aa1~aa26)。本研究检测并分离到1株BSRV,揭示了该病毒基因组的遗传进化特征,为国内BRSV的深入研究奠定了基础。

牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的生物学功能

牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)是一种在世界范围内引起牛呼吸道疾病的病毒性病因之一,主要引起1岁龄以下犊牛的严重下呼吸道感染。BRSV共编码9种结构蛋白,其中附着蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)是BRSV表面主要的包膜糖蛋白,参与病毒吸附、融合宿主细胞的过程。G和F蛋白含多种识别表位,能够刺激机体产生中和抗体反应,常常是牛呼吸道合胞体病(bovine respiratory syncytial disease, BRSD)疫苗开发所关注的重点。探究G和F蛋白在BRSV侵染中的作用机理对于病毒致病机理分析、疫苗开发具有重要意义。本文旨在对牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的结构功能及有关疫苗的开发加以综述,以期为BRSV疫苗的研制和BRSD的防控提供参考。

牦牛呼吸道合胞体病毒与A型巴氏杆菌混合感染的诊断

2023年5月川西北某牦牛养殖场暴发呼吸道疾病并出现死亡,本试验的目的是对此疫情进行病原学诊断。采集了3份病死牦牛肺脏样本,采用PCR方法对肺脏样本进行了10种常见呼吸道病原的检测。结果显示,2份样本检出牛呼吸道合胞体病毒,2份样本检出A型多杀性巴氏杆菌,其中1份样本同时检出牛呼吸道合胞体病毒和A型多杀性巴氏杆菌。结合临床资料和实验室检测结果,诊断该养殖场牦牛暴发的呼吸道疾病是由牛呼吸道合胞体病毒和A型多杀性巴氏杆菌混合感染引起的,为该场牦牛的疾病防治提供可靠依据。

表达牛呼吸道合胞体病毒G蛋白基因的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建与鉴定

为构建表达牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白基因的牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)重组病毒,本研究将人工合成的BRSV全长G蛋白基因编码序列插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建TK基因缺失转移载体。利用磷酸钙-DNA沉淀法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过反向蚀斑筛选,得到重组病毒BHV-1/TK-/G+。PCR检测结果证实G蛋白基因已经插入到了亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组中,间接免疫荧光试验和western blot证实BHV-1/TK-/G+中的G蛋白基因在感染的细胞中获得了表达。本研究为研制BRSV及其他重要牛传染病的BHV-1病毒活载体疫苗奠定了基础。

牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻汁中分离到1株病毒,并对其进行了系统鉴定。结果该病毒株能在Vero细胞上增殖并产生特征性的合胞体形态的细胞病变;病毒对5-碘脱氧尿核苷不敏感,对酸、氯仿、乙醚均敏感,不耐热,56℃加热30 min可被灭活,且无血凝性和血吸附特性;该病毒能被牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）标准阳性血清中和;应用特异性引物,通过反转录-聚合酶链式反应可从病毒细胞培养物中扩增出BRSVN基因中596 bp的特异性片段,并且分离株与GenBank中BRSV毒株N基因相应片段的核苷酸序列同源性为97.8%-99.3%。以上结果表明所分离到的病毒为牛呼吸道合胞体病毒,命名为BRSV HJ株。

牛呼吸道合胞体病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立及应用

【目的】以纯化的牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)HJ株重组N蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测BRSV抗体的间接ELISA方法。【方法】将已构建的重组菌BL21(DE3)进行诱导表达,获得重组N蛋白。利用电洗脱法对表达产物进行纯化,并用Western blot对表达产物进行鉴定。以纯化后的重组N蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测BRSV抗体的间接ELISA诊断方法。【结果】成功表达并纯化了BRSV HJ株重组N蛋白,Western blot检测结果证明表达产物具有良好的反应原性。以重组N蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。交叉试验结果表明重组N蛋白与牛无浆体病(Anaplasmosis)、牛传染性鼻气管炎(IBRV)和牛副流感(BPIV)阳性血清均不发生交叉反应。与中和试验(SNT)相比较,该方法的特异性、敏感性和符合率分别为85.0%、90.9%和87.7%。采用本试验建立的间接ELISA方法对黑龙江省的牡丹江、佳木斯、鹤岗和大庆4个地区牛场的600份牛血清进行了检测,结果表明,黑龙江省部分地区BRSV的抗体阳性率为27.33%。【结论】本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实黑龙江省部分地区存在牛呼吸道合胞体病。这一研究为牛呼吸道合胞体病诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。

套式RT-PCR检测牛呼吸道合胞体病毒的研究

为了检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),根据已发表的融合蛋白(F)基因序列,设计了套式RT-PCR引物,初步建立了BRSV的套式RT-PCR检测方法。对138份牛鼻腔棉拭子进行了检测,结果检测到了BRSV阳性样品54份,总的阳性检出率为39.1%。对大部分BRSV阳性样品的F基因扩增产物进行了序列测定与分析。用该套式RT-PCR对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒等进行了检测,结果无交叉反应,表明该检测方法具有良好的特异性。本研究首次用套式RT-PCR技术证实了我国部分省的牛群中存在BRSV感染。

牛呼吸道合胞体病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBankTM上发表的牛呼吸道合胞体病毒核衣壳蛋白N基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增大小为596bp的目的片段,通过特异性试验、敏感性试验和重复性试验建立了牛呼吸道合胞体病毒的RT-PCR检测方法。所建立的牛呼吸道合胞体病毒的RT-PCR方法与牛腺病毒、牛副流感病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛无浆体均无交叉反应,该方法的敏感性可达1TCID50。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强和重复性好等特点,可作为牛呼吸道合胞体病毒检测的一种方法。

牛呼吸道合胞体病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。方法以重组纯化的BRSV-G蛋白免疫家兔和小鼠,制备抗G蛋白的多克隆抗体(PcAb)和单克隆抗体(MAb),方阵滴定法优化DAS-ELISA方法抗体工作浓度及反应条件,并对其敏感性、特异性、符合率进行验证。结果获得5株稳定分泌抗G蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分泌抗体亚类均为IgG1型κ链,Western blot、IFA试验表明PcAb和MAb均与G蛋白和BRSV发生特异性反应,MAb作为捕获抗体的最佳包被浓度为2.5μg/mL,PcAb作为检测抗体最佳工作浓度为5μg/mL,判定临界值为0.22,最低检测限为1.43μg/mL,批内和批间重复性试验变异系数均小于10%,与常引起牛呼吸道疾病的几种病原均无交叉反应,与RT-PCR的敏感性、特异性、符合率分别为92.0%、100%、95.6%。结论建立的检测BRSV的DAS-ELISA方法可用于临床样品的大规模检测,为BRSV疫情的监测和快速诊断奠定了基础。

主要病毒性牛呼吸道疾病的研究进展

牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease,BRD)是引起舍饲牛发病和死亡的主要原因,给北美和世界养牛业造成巨大的经济损失。BRD是由多种病毒、细菌与外界环境相互作用,如应激、环境因素与多种病毒、细菌和支原体等而引起的一种严重的呼吸系统疾病。作者就引起BRD的常见和严重的病原牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)的生物学特性、细胞感染和致病机制等进行简要概述,以期为该病的防制和研究提供参考。

内蒙古某肉牛场呼吸道疾病病原的分离鉴定

2017年5月,内蒙古某肉牛场暴发呼吸道疾病,为了确诊该次疾病的病原,无菌采集牛鼻汁接种于鲜血琼脂培养基进行细菌的分离鉴定,同时对牛鼻汁中的病原进行PCR检测,并针对分离菌进行药物敏感性试验。根据细菌分离结果将该分离菌初步鉴定为链球菌;药敏结果显示,该分离菌对阿米卡星、壮观霉素、强力霉素和阿奇霉素高度敏感。PCR检测结果显示,病料中的牛呼吸道合胞体病毒和支原体PCR检测结果为阳性。由以上结果可以得出引起该肉牛场肉牛发病的病原为牛呼吸道合胞体病毒、支原体和链球菌。

多杀性巴氏杆菌与牛呼吸道合胞体病毒混合感染的诊断

牛呼吸疾病道综合征(BRDC)给全球养牛业的健康发展带来了严重威胁。安达市某牛场爆发呼吸道疾病,为了确诊此次疾病的病因,本文通过细菌分离鉴定、呼吸道病毒PCR检测及药物敏感性试验,检测结果显示为多杀性巴氏杆菌与牛呼吸道合胞体病毒混合感染,药敏结果显示,此菌对恩诺沙星等药物高度敏感,为今后临床处理此类疾病提供理论依据。

牛呼吸道合胞体病毒流行病学的研究

牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是一种有包膜单股负链RNA病毒,属于副粘病毒科中肺病毒属病毒成员。自从20世纪70年代初BRSV被确认为是牛犊中引起呼吸道疾病的主要原因。众多免疫学和分子生物学方法的出现方便BRSV的研究。尽管如此,流行病学、分子流行病学和病毒的进化等许多方面仍然没有完全了解。自然感染过程的复杂使诊断更难,急需更好的治疗预防措施控制疾病。了解BRSV才能够建立感染机制,才能防止病毒和疾病的传播。本文综述了有关BRSV流行病学和分子流行病学的重要信息,并突出了病毒进化在病毒传播中的重要性。

牛呼吸道合胞体病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛呼吸道合胞体病毒的全序列,选择保守性较强的N基因序列,利用Primer5.0设计合成特异性引物,建立能快速检测牛呼吸道合胞体病毒的RT-PCR方法。利用本方法对采集的38份临床症状类似的牛呼吸道合胞体病毒进行检测,检测结果中有10份为阳性。试验证明该方法具有很高的特异性及敏感性,能检测到1pg左右的病毒RNA,是一种快速有效的检测方法。

新疆部分地区集约化牛场牛呼吸道合胞体病毒的流行病学调查

为了解新疆部分地区集约化牛场牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的流行及分型情况,本研究从新疆7个地区14个集约化牛场采集了407头犊牛的血液及其对应的鼻拭子,分离血清,利用ELISA检测犊牛血清中的BRSV抗体,结果显示,犊牛血清中的BRSV抗体阳性率为82.1%(334/407),各地区BRSV抗体阳性率在70%~100%,其中克拉玛依和伊犁两地BRSV抗体阳性率高达100%。9周龄以内犊牛BRSV抗体阳性率较高,为86.1%~100%,但9周龄以后BRSV抗体阳性率呈下降趋势,且12周龄以上犊牛BRSV的抗体阳性率下降至31.8%。利用套式RT-PCR(F基因引物)对鼻拭子检测结果显示,仅伊犁、石河子两地共17份样品检测结果为BRSV阳性,阳性率分别为7.4%(2/27)和7.5%(15/200)。5周龄犊牛BRSV的阳性率最高为21.7%(5/23),且BRSV阳性的犊牛均在12周龄以内。上述结果表明,新疆部分地区牛场犊牛存在BRSV的感染,且BRSV抗体阳性率也较高,在不同地区犊牛BRSV及其抗体的阳性率均存在差异。采用套式RT-PCR扩增17份BRSV阳性样品的G基因并测序,利用MegAlign软件中的clustal W算法分析G基因的同源性,利用MEGA 7.0软件中的NJ法构建G基因的进化树,分析其遗传进化关系。结果显示,17份阳性样品均扩增到371 bp的G基因片段。同源性及遗传进化分析结果显示,17条G基因序列均与美国Ⅲ亚群BRSV参考株USII/S1 G基因的同源性最高,为91.6%~94.4%。且它们均与美国Ⅲ亚群BRSV参考株USII/S1位于同一大分支。上述结果表明,17条G基因序列可能均来自美国的BRSV USII/S1参考株,且均为Ⅲ亚群BRSV。本研究为新疆部分地区BRSV感染的防控提供了数据支持。

基于牛呼吸道合胞体病毒融合前F蛋白的间接ELISA方法的建立与应用

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗牛Ig G-HRP的稀释度为1:8000,抗体阴阳性临界值为0.204。特异性试验结果显示,该ELISA方法与阿卡斑病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,当BRSV阳性血清稀释倍数达1∶6400时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感性。重复性试验结果显示,ELISA组内、组间最大变异系数分别为6.80%和8.80%,表明该方法的重复性良好。对195份临床牛血清样品检测结果显示,BRSV抗体阳性率为61.0%;对其中的143份血清同时进行病毒中和试验检测,结果显示二者符合率为89.5%。上述结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于牛群中BRSV抗体的检测,为BRSV的血清流行病学调查提供可靠的技术手段。

牛呼吸道合胞体病毒检测方法研究进展

牛呼吸道合胞体病毒是引起牛呼吸道疾病的主要病原之一。进行牛呼吸道合胞体病诊断时,首先通过临床症状观察以及病理剖检变化进行初诊,然后再进行实验室诊断。其实验室检测主要依赖于病原学诊断和血清学诊断,病原学诊断方法主要包括细胞分离培养鉴定、聚合酶链反应。血清学方法包括中和试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等。近年来聚合酶链反应﹑酶联免疫吸附试验等方法得到快速发展,凭借其高效、快速、灵敏性高的特点成为牛呼吸道合胞体病毒检测的常用方法。牛呼吸道合胞体病在全球范围内流行,对各国养牛业造成极大危害。论文综述了牛呼吸道合胞体病毒检测方法的研究进展,为牛呼吸道合胞体病的诊断和预防提供参考。

牛呼吸道合胞体病毒主要编码蛋白研究进展

牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是引起反刍动物呼吸道疾病的主要病毒之一,犊牛对该病毒的感染率、发病率和病死率均较高,严重危害养殖的经济效益。牛呼吸道合胞体病毒主要编码蛋白F蛋白和G蛋白上的某些抗原表位可刺激中和抗体反应,而且是BRSV唯一能够在动物模型中诱导中和抗体并产生保护性免疫应答的蛋白。N蛋白具有高度保守性,可诱导BRSV的保护性免疫,小疏水性蛋白(SH)有助于维持病毒外壳稳定性。目前,在该病的防控措施上仍然存在未解决的问题,可根据BRSV编码蛋白的不同特性与功能,研发出一种免疫效果良好、安全高效的疫苗,用以防控BRSV的感染。

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗原区原核表达及反应原性鉴定

本研究旨在获得重组牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白并对其进行反应原性鉴定。从NCBI上找出G基因的核苷酸序列,分析其抗原区域,利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段,将目的片段连接到克隆载体pMD19-T后,对其进行双酶切鉴定和测序。将双酶切后的目的片段进行胶回收,构建重组质粒pET-32a-G,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用Ni-IDA亲和层析法纯化经IPTG诱导表达的蛋白,并测定其浓度;通过SDS-PAGE和Western blotting方法对该蛋白进行分析与鉴定。结果显示,本试验成功克隆出大小约为567 bp的G基因,获得分子质量约为40 ku的可溶性重组蛋白,优化诱导条件后用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,在16℃、IPTG浓度1.2 mmol/L、诱导4 h时蛋白表达量最大;通过Western blotting检测发现,重组蛋白可与山羊源BRSV标准阳性血清发生特异性反应,说明该蛋白具有反应原性。综上,本研究成功表达并纯化了BRSV G蛋白,为建立BRSV抗体间接ELISA检测方法和BRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。