副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失株的部分生物学特性

副猪嗜血杆菌(HPS)是引起猪格拉瑟病(Glasser’s disease)的病原菌,给全球和中国规模化养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌血清型众多,其中血清7型是近年来分离比例越来越高的血清型,也是危害越来越严重的血清型。crp是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中对细菌适应环境变化起着至关重要的作用。为了筛选副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失弱毒株,采用自然转化法构建了副猪嗜血杆菌血清7型临床分离株HPS7的crp基因缺失株,对HPS7及其crp基因缺失株的生长特性、生物膜形成、抗药性、毒力等进行了研究。结果表明,HPS7的crp基因缺失后,生长显著减慢,自凝速度减慢,生物膜形成能力明显减弱,对大部分抗生素的抗性降低,对豚鼠的毒力降低。以上结果说明crp基因对HPS7的生长、抗药性、毒力均有明显影响。本研究结果为筛选副猪嗜血杆菌血清7型弱毒株提供了参考。

防御假单胞菌H78中crp基因对抗生素合成的调控作用

crp基因(编码cAMP受体蛋白)作为全局调控因子广泛存在于各种细菌中,在不同菌株中表现不同的调控功能。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)H78能产生硝吡咯菌素(Prn)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)和藤黄绿菌素(Plt)等多种广谱抗生素。为探究P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成的调控作用,利用基因无痕敲除、HPLC分析、lacZ报告基因分析等技术,分析crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成及基因表达的影响。结果表明:H78菌株中crp基因的敲除导致Prn合成操纵子prnABCD表达显著下降;Plt合成及操纵子表达显著上升;2,4-DAPG合成及操纵子表达小幅下降。因此,P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn合成存在显著的正调控作用,而对Plt合成存在明显的负调控作用,对2,4-DAPG合成存在一定的正调控作用。

cya/crp基因缺失对鸡白痢沙门菌生物学特性影响的研究

为了解crp/cya基因对鸡白痢沙门菌毒力和生物学特性的影响,本研究构建缺失1182 bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya,并经酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌χ7213作为供体菌,分别以鸡白痢沙门菌C79-13株和本研究室前期构建的其crp基因缺失株C79-13Δcrp(简写为Δcrp)为受体菌,利用重组自杀性质粒介导的同源重组技术构建C79-13菌株的单基因缺失株Δcya以及双基因缺失株ΔcrpΔcya,并均经PCR和测序鉴定。将这3株菌连续传60代后每隔10代分别利用PCR鉴定cya基因缺失的遗传稳定性;利用玻片凝集试验鉴定各菌株的血清型,并鉴定各菌株的生化反应特性;绘制各菌株的生长曲线分析缺失株与亲本株的生长特性;通过微量结晶紫法检测各菌株的生物被膜(BF)形成能力。PCR和测序鉴定结果显示Δcya、ΔcrpΔcya均正确构建,且cya基因缺失均具有稳定的遗传性。血清型及生化鉴定结果显示,菌株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya均保留了C79-13的O9血清型,而失去了发酵蔗糖、鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖等糖类的能力。生长曲线及BF形成能力的检测结果显示,各缺失株的生长速度较亲本株相比均显著降低,尤其双基因缺失株ΔcrpΔcya的生长速度极显著下降(P<0.01),且基因缺失株BF的形成能力均极显著降低(P<0.01),其中双基因缺失株BF的形成能力更低。将3株缺失菌及亲本菌分别以不同的剂量(5×10^(8)cfu/只~7×10^(11)cfu/只)经腹腔注射感染雏鸡进行毒力试验,计算各菌株对雏鸡的半数致死量(LD_(50))。将各缺失株以10^(7) cfu/mL两次经灌服免疫雏鸡,100μL/只,二免后7 d各组雏鸡均以5.0×10^(8)cfu/mL经腹腔注射亲本菌株C79-13进行攻毒试验,500μL/只,在42 d的观察期内观察并记录各组鸡的发病及死亡情况,计算各基因缺失株对雏鸡的免疫保护率。结果显示,缺失株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya对雏鸡的LD_(50)分别为2.84×10^(9) cfu/mL、1.41×10^(10)cfu/mL、2.51×10^(11)cfu/mL,与亲本菌株C79-13相比,各缺失株LD_(50)分别升高约1.1×10^(3)倍、5.7×10^(3)倍、1.0×10^(5)倍;各组雏鸡攻毒后出现精神沉郁症状,且有部分鸡死亡,PBS对照组鸡出现排稀便症状,且全部死亡。Δcya、Δcrp及ΔcrpΔcya对雏鸡的免疫保护率分别为60%、80%、50%。表明各基因缺失株均能够对雏鸡提供一定的免疫保护效果,且单基因缺失株Δcrp的免疫效果最好。本研究首次对鸡白痢沙门菌crp、cya基因生物学功能做了初步研究,并证实缺失株Δcrp有望作为一种鸡白痢沙门菌基因缺失疫苗的候选菌株,为研制安全有效的沙门菌弱毒活疫苗奠定了基础。

CRP基因多态性与缺血性脑卒中关联性的研究进展

C反应蛋白(C reactive protein,CRP)是心脑血管疾病的独立危险因子,而C反应蛋白的单核苷酸多态性(SNP)与C反应蛋白的水平相关。因此,检测CRP基因序列的变异可能会有助于对心脑血管系统疾病的预测。本文主要对当前CRP基因多态性与缺血性脑卒中的关联性的研究现状加以综述。

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H_(2)S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H_(2)S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性降低,对四环素类药物的敏感性增强,A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉以外的12种药物的敏感性增强。小鼠毒力试验结果显示,与亲本株的LD_(50)(2.479×10^(4)cfu)相比,A29Δcrp的LD_(50)(5.379×10^(5) cfu)和A29Δhfq的LD_(50)(5.012×106 cfu)均明显上升。各菌株感染小鼠后的临床症状及各组织剖检病变基本一致;组织病理变化观察显示,与亲本株相比,A29Δcrp组小鼠肝组织可见多量大小不一的坏死灶,脾组织红髓面积增大、白髓面积减小,A29Δhfq对小鼠脾脏、肝脏及脑组织损伤均较小。本研究为探究鼠伤寒沙门菌crp和hfq基因功能奠定了基础,同时也为进一步研发鹅沙门菌病疫苗提供了参考依据。

鼠伤寒沙门菌crp基因缺失株SL1344Δcrp生物学特性的测定

为研究crp基因缺失后引起的减毒机制,本试验对鼠伤寒沙门菌crp基因缺失株SL1344Δcrp的有关生物学特性进行了测定。结果显示,与亲本菌株相比,缺失株失去了运动能力;SL1344Δcrp不表达纤维素和菌毛,不能形成生物被膜;SL1344Δcrp对细胞增殖和细胞毒性的影响均弱于亲本菌株;crp基因缺失后缺失株对上皮细胞的黏附和侵入能力与亲本菌株相比无明显差异。上述结果表明,crp基因不仅是重要的毒力基因,还是生物被膜形成的调控基因;这些结果为深入研制以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

鸭疫里默氏杆菌类似crp基因的鉴定及其突变株对雏鸭免疫效果的评价

旨在鉴定鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)中的crp基因,并探究该基因与菌株毒力的关系,了解crp基因突变株的免疫保护效力,为开发新型R.anatipestifer减毒活疫苗奠定基础。采用P-BLAST在R.anatipestifer蛋白质组中搜寻与沙门菌crp基因相似的蛋白基因,发现R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因与沙门菌crp基因相似度为45%;将B739-0373基因克隆到表达载体上,并回补到沙门菌!crp突变株中,利用麦芽糖-麦康凯培养基颜色反应对其糖代谢功能进行鉴定,结果发现该基因可完全回补沙门菌自身crp的缺失,推测R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因具有类似沙门菌crp基因的功能;利用同源重组和自杀质粒,构建R.anatipestifer CH-1Δcrp突变株,比较野生及突变株的生长情况和毒力(包括黏附率、侵染率、LD50、在雏鸭肝脑中的定殖能力),结果表明,crp基因的缺失使菌株生长变得缓慢,黏附力(P<0.01)和侵染力(P<0.001)显著下降,对雏鸭的半数致死量(LD50)显著提高,在雏鸭肝脏、脑中定殖能力也显著下降(P<0.01);在CH-1Δcrp突变株免疫雏鸭后7,14,21d,检测雏鸭血清中IgG水平,并以R.anatipestifer野生株对免疫后的雏鸭进行肌注攻毒,观察其临床症状和免疫保护率,发现Δcrp突变株能刺激雏鸭产生高水平的IgG抗体(P<0.01),对雏鸭的免疫保护率为100%。综上表明,B739-0373基因鉴定为R.anatipestifer CH-1株的类似crp基因,可全局调控该菌株的生长和毒力;安全剂量的CH-1Δcrp突变株可诱导雏鸭产生较强的免疫保护效力,可作为新型减毒活疫苗的候选菌株。

猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。

具有不同C反应蛋白基因(+1059G>C)的牙周炎患者对牙周基础治疗的反应性

目的:评估携带不同C反应蛋白(+1059G>C)基因患者对牙周基础治疗的反应性。方法:选取新疆汉族慢性牙周炎患者43例,根据C反应蛋白(+1059G>C)基因分型。其中GG型37例,GC型4例,CC型2例,在口腔局部麻醉下接受完整的牙周龈上洁治和和龈下刮治手术。分别对治疗当日(基础浓度),治疗后第1天、第7天的C反应蛋白(CRP)血液浓度检测。根据患者携带CRP(+1059G>C)基因类型和其CRP血液浓度进行统计分析。结果:在第1天和第7天,CRP血液浓度在GG型和GC+CC型之间有差异(P<0.05);CRP血液浓度在GG型和CC型之间有差异(P<0.05)。结论:在同等的牙周手术刺激下,CRP基因CC型相对于GG型上调CRP水平不显著,与体内低水平CRP相关,可能是预防冠心病的基因。

鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。

深静脉血栓患者C反应蛋白1059 G/C基因多态性的研究

本研究旨在探索C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)1059G/C基因多态性在深静脉血栓(deep veinthrombus,DVT)中的分布及其临床意义。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)基因分型技术检测61例DVT患者和60例对照组CRP1059G/C基因多态性,并统计各基因型及等位基因的频率。结果显示,病例组CRP1059G/C基因型及等位基因突变频率与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结论 :CRP1059G/C基因多态性存在一定的人种及地域差异,是否是DVT患者遗传性危险因素尚有待进一步研究。

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。

减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株的构建及其对雏鸡的免疫活性

为构建鸡白痢沙门氏菌C79-13株Δcrp基因缺失突变株,并初步观察ΔcrpC79-13缺失菌株作为活疫苗对雏鸡的免疫活性,将含缺失320bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp与C79-13进行接合转移,两步法筛选出无抗性标记的ΔcrpC79-13缺失菌株;通过半数致死量测定其毒力;给4日龄雏鸡口服免疫缺失菌株,在不同时间点根据胸腺、法氏囊、脾等免疫器官发育和平均日增重、外周血淋巴细胞转化试验、Griess法NO测定及血清IgG动态观察免疫水平。结果显示ΔcrpC79-13的毒力较C79-13降低约99.6%(LD50>5.0×109CFU);雏鸡接种ΔcrpC79-13(1.0×109 CFU/只)后不影响雏鸡生长,第14～21天体内特异性细胞和体液免疫水平达到最高。表明成功构建了减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株,其毒力显著降低,免疫雏鸡安全,具有良好的免疫活性。

C反应蛋白基因型与慢性牙周炎和冠心病相关性研究

目的:探讨CRP基因(+1059G>C rs1800947,+1444C>T rs1130864)的基因型、单倍型与慢性牙周炎、冠心病、慢性牙周炎伴冠心病易感性的关系。方法:中重度慢性牙周炎患者100例(CP组)、冠心病患者98例(CHD组)、中重度慢性牙周炎伴冠心病患者92例(CP伴CHD组)与125例健康对照者(对照组)的颊黏膜拭子,提取DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法对+1059G>C rs1800947,+1444C>T rs1130864位点的基因分型,及对PC伴CHD组和对照组测序检测2个多态性位点单倍型。结果:CRP多态性位点rs1800947和rs1130864的等位基因在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。2个多态性位点的等位基因在CP伴CHD组差异有扩大的趋势。CRP基因位点(rs1800947,rs1130864)的单倍型GT在CP伴CHD组和对照组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:单倍型GT可能是冠心病与慢性牙周炎的易感基因。

肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其在生物膜形成中的作用

目的构建肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因(crp基因)缺失突变株与回补株,了解crp基因在肺炎克雷伯菌生物膜形成中的作用。方法设计位于crp基因(566 bp)上游698 bp片段及下游576 bp片段的两对引物,分别扩增出相应片段并通过融合PCR构建一个1 274 bp片段的突变盒,利用双酶切克隆的方法将突变盒克隆至温度敏感性自杀载体pKO3-Km的NotⅠ位点间,电转化至肺炎克雷伯菌中构建肺炎克雷伯菌crp基因无痕缺失突变株(Δcrp)。扩增包含crp基因编码、启动子结合区及转录终止区的2 063 bp基因片段并克隆至pGEM-T-easy质粒上,将此质粒电转至crp基因缺失突变株中构建crp基因回补株(C-crp)。采用RT-PCR方法检测crp基因在基因缺失株与回补株的表达情况,确定crp基因缺失突变株与回补株构建成功。利用结晶紫染色法检测crp基因对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响,并通过酵母凝集试验检测crp基因对肺炎克雷伯菌的菌毛形成影响。结果成功构建了肺炎克雷伯菌crp基因缺失突变株与回补株,RT-PCR结果显示,crp基因在缺失突变株中无表达,在回补株重新表达。体外试管静止培养48 h后,crp基因缺失株无明显生物膜形成,而在野生株及回补株的液体培养基表面形成宽厚生物膜。结晶紫染色定量发现,crp缺失突变株的生物膜相对形成量显著低于野生株(0.063±0.011 vs 1.020±0.056,P<0.001)。酵母凝集试验发现在crp基因缺失突变株中细菌菌毛生成能力下降,提示crp基因影响肺炎克雷伯菌菌毛的生成。结论肺炎克雷伯菌crp基因可能通过调控肺炎克雷伯菌菌毛生成而正调控细菌生物膜的形成。

肺炎克雷伯菌CRP调控子对细菌毒力影响与机制研究

目的:了解肺炎克雷伯菌调控因子CRP对细菌毒力的影响及其对毒力相关因子磷酸转移酶系统的作用及其机制。方法:构建肺炎克雷伯菌CRP调控因子的基因缺失突变株与回补株,小鼠毒力试验检测CRP对细菌LD50的影响及小鼠生存率的影响,qRT-PCR与lac Z报告基因检测CRP对果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因的影响并通过凝胶阻滞试验(EMSA试验)检测CRP调控frwC基因的机制。结果:CRP基因敲除菌株的小鼠毒力明显下降,野生株、CRP基因缺失株及回补株的LD50分别为<100,3.2×10~5和4.5×10~4CFUs。qRT-PCR与lac Z报告基因发现CRP基因敲除后,果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因表达量明显下降,EMSA试验发现CRP蛋白能够结合在frwC启动子区。结论:肺炎克雷伯菌CRP调控子与细菌毒力密切相关,并且能够直接正调控frwC基因的表达。除影响细菌荚膜、菌毛、生物膜的形成而影响细菌毒力外,CRP调控子可能通过影响磷酸转移酶系统而影响细菌毒力。