猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为:抗原包被浓度为3.15μg/mL,待检血清稀释度为1∶40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性血清检测呈阴性反应。批间、批内试验变异系数均不超过8%。用该方法与HerdChek ELISA试剂盒同时对119份血清进行了平行检测,其相对敏感性、特异性和符合率分别为:75%、80.7%和79%。试验结果表明:猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病毒血清抗体检测。

伪狂犬病毒中和抗体与gB-ELISA抗体阻断率之间的相关性

为了测定伪狂犬病毒中和抗体与gB抗体之间的相关性,本试验用216份伪狂犬病毒中和抗体阳性血清,对每一份样本作4种不同的稀释(1∶1、1∶20、1∶40、1∶80),用Idexx公司的gB-ELISA试剂盒检测。试验结果表明:216份中和抗体阳性血清样品中,有7份gB抗体阴性,阳性检出率为97.8%(209/216);随着中和抗体效价的增高gB-ELISA OD650值降低;gB抗体阻断率随中和抗体效价的增高而增加;对同一份血清样本作1∶1、1∶20、1∶40、1∶80稀释,测定结果发现,随着稀释度的增加,gB抗体阻断率逐渐降低,而gB-ELISAOD650值逐渐升高。

牛传染性鼻气管炎病毒gB ELISA抗体与中和抗体相关性分析

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是牛传染性鼻气管炎(IBR)的病原体,常引起流产和呼吸道感染等综合征,给养牛业造成了巨大经济损失。gB作为IBRV中最保守的抗原蛋白,是IBRV诊断的重要靶蛋白。为探究牛gB–ELISA抗体水平与VNT效价的相关性,本研究采用阻断ELISA和VNT两种不同的方法对某一牛场50份血清进行IBRV gB ELISA抗体检测和中和抗体测定。gB ELISA结果显示,阳性血清19份,阴性血清31份;中和抗体结果阳性17份,阴性33份。通过统计学相关系数分析,gB抗体阻断率和中和抗体效价值的相关系数为1.0,从而说明IBRV gB ELISA抗体和中和抗体呈较强的正相关。本研究为使用IBRV gB ELISA抗体水平评估牛群中IBRV抗体保护效果提供理论依据。

猪伪狂犬病野毒阳性场gE和gB抗体检测以及与阴性场gB抗体对比分析

试验分别采集某猪伪狂犬病野毒阳性场和阴性场6个阶段共409份血清样品,通过ELISA（酶联免疫吸附试验）方法检测阳性场g E和g B抗体水平、阴性场g B抗体水平。阳性场结果显示：g E抗体总阳性率为49%,每个阶段猪群均有伪狂犬病野毒感染,经产母猪和公猪g E抗体阳性率分别为40%和16%;30~150日龄g E抗体阳性率逐渐上升,从14%上升到100%,g E抗体S/N值呈下降趋势。说明仔猪在保育和肥育阶段再次感染了伪狂犬病野毒,提示转群是猪伪狂犬病野毒攻击点。g B抗体总阳性率为89%,其中种猪群高达100%,30~40日龄g B抗体阳性率为93%,与母猪抗体水平一致,60~70日龄母源抗体急剧下降,g B抗体阳性率只有50%,90日龄后抗体水平逐渐上升,到150日龄时高达100%,说明伪狂犬病g B母源抗体在60~70日龄消失,而90日龄后抗体上升,可能是野毒感染和免疫抗体综合作用所致。阴性场结果显示：g B抗体总阳性率为92%,比阳性场高,其中种猪群g B抗体阳性率均高达100%,30~40日龄g B抗体阳性率为83%,60~70日龄时母源抗体开始消退,g B抗体阳性率只有60%,70日龄后经过两次疫苗免疫,g B抗体水平显著提升,到90日龄后阳性率一直保持100%。阳性场和阴性场g B抗体比较而言,g B抗体水平种猪群都比较稳定;仔猪母源抗体都在60~70日龄消退,母源抗体下降趋势基本一致;阳性场的g B抗体总体阳性率比阴性场低,S/P平均值反而更高,因此离散度大,阴性场g B抗体水平的整齐度更好;阳性场S/P〉4.0的比例比阴性场高6个百分点;阳性场肥育猪疫苗免疫效果不及阴性场明显,疫苗第1次免疫后g B抗体水平提升速度比阴性场慢,第2次免疫后g B抗体均能达到理想水平,都具有很好的保护性,但阳性场g B抗体无法区分是来自于疫苗免疫还是野毒感染。综上分析,猪伪狂犬病野毒阳性场和阴性场疫苗免疫不能“一刀切”,而应该根据其血清学检测结果及阴、阳性场的特殊性制定合理的免疫程序,对于阳性场还要狠抓野毒攻击点,以期达到伪狂犬病净化的目的。

某规模化猪场猪伪狂犬gE和gB抗体的检测与分析

[目的]了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水平.[方法]采用ELISA法对2010～2013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1 217份进行猪伪狂犬野毒（gE）抗体和免疫（gB）抗体检测.[结果]种猪与育肥猪猪伪狂犬野毒总样品阳性率分别为13.5％和28.4％,其中60～ 100日龄的育肥猪总样品阳性率为5.2％,100 ～210日龄的总样品阳性率为42.1％;种猪伪狂犬免疫抗体总样品阳性率分别为92.2％,60 ～160日龄的育肥猪猪伪狂犬免疫抗体阳性率呈波动变化,血清样品总阳性率为50％.[结论]该猪场育肥猪群野毒感染率较种猪群高,且100日龄以后的育肥猪群野毒感染率较高,种猪群的免疫抗体水平高于育肥猪群,80～130日龄育肥猪免疫抗体水平较低.

猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

目的分段表达伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因,用于PRV疫苗免疫抗体评估试剂盒研究。方法分析gB抗原表位,设计4对特异性引物,从PRV新疆分离株中扩增gB基因的4个片段,分别命名为gB-1、gB-3、gB-4和gB-5基因,克隆到pGEM-T-easy载体并测序。再将4个gB基因片段融合到pGEX-6P-1原核表达载体中,表达并纯化。Western Blotting进行重组蛋白的抗原性检测。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测猪血清临床样品。结果构建的4种表达质粒均可在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,表达分子量分别为75.05、53.86、49.96和49.72×103Da,其中gB-3、gB-4和gB-5表达量较高,表达产物主要存在于包涵体中。Western Bloting鉴定显示,4种融合蛋白均可被猪伪狂犬阳性血清特异识别。以gB-3、gB-4和gB-5建立的ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒符合率分别为40.9%、81.8%和81.8%。结论本研究成功表达了PRV的gB-1、gB-3、gB-4和gB-5重组蛋白,gB-3、gB-4和gB-5表达量较高;其中以gB-4和gB-5建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的符合率较高。

伪狂犬病病毒gB基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立评价伪狂犬病疫苗免疫效果的方法,应用PCR方法扩增gB基因的主要抗原表位区序列,大小为768bp,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pETgB768,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,通过IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白的表达情况及其反应原性。用纯化的gB768蛋白作为包被抗原建立间接gB768-ELISA检测方法,试验结果表明,该方法具有良好的敏感性、特异性、重复性。用该方法检测128份临床送检猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较,符合率为93.8%。该方法的建立为猪伪狂犬病疫苗免疫效果的评估奠定了基础。

生猪伪狂犬病毒gB抗体与中和抗体的相关性分析

为探索生猪伪狂犬病毒gB–ELISA抗体水平的高低与中和抗体效价的相关性,运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对177份生猪血清进行了伪狂犬病毒gB抗体的检测,同时,用中和试验对上述血清样品进行了伪狂犬病毒中和抗体的测定。试验结果通过生物统计学分析,gE抗体阴性血清的g B抗体平均S/P值和中和抗体效价(SN效价)倒数平均值的相关系数为0.926,说明g B免疫抗体S/P值与其中和抗体效价有很好的相关性。中和抗体水平的高低一般与免疫保护力呈正相关,研究结果表明gB–ELISA抗体水平可以用来评估生猪对当前流行PRV毒株的相对免疫保护力。

GB病毒B型(GBV-B)感染的临床与免疫病理研究

目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子.1995年 Simons et al 成功地克隆出2株黄病毒 RNA 序列,称之为 GBV-A,GBV-B.继而从一名西非患者血清中克隆出另一黄病毒 RNA 序列,称之为 GBV-C.1996年初美国另一研究小组从一名慢性输血后肝炎患者血清中克隆出一株黄病毒 RNA 序列,称之为 HGV.进一步的研究后认为 GBV-C,HGV 为同一病毒的不同分离株.动物实验发现,GBV-B 可单独引起动物发病,而 GBV-A 单独感染时未能引起发病.本文以此为依据,对 GBV-B 感染者的临床与免疫病理加以研究,试图探讨 GBV-B 对人体肝脏的致病性及其在人体内的分布状态.方法根据 GBV-B NS5区的核苷酸和氨基酸序列,通过计算机软件对其抗原位点进行了预测,并分析其亲水性、键流动性、电荷状态及抗原表位分布等特性,合成一条30个氨基酸多肽.探讨合成肽最佳包被量之后,成功地建立了间接 ELISA 法,用来检测抗-GBV-B.应用此方法检测各型肝炎及其他高危人群血清标本1286份.同时应用 RT-PCR 检测血清中 GBV-B RNA及免疫组化检测肝炎患者肝组织相关病毒抗原.结果经鉴定合成肽纯度在95%以上,氨基酸分析的实际值与理论值基本一致.将合成肽与牛血清清蛋白(BSA)偶联免疫白兔获得高效价抗-GBV-B NS5区的多克隆抗体(PcAb).批内、批间变异系数分别为6.06%和7.65%(均<10%);中和抑制试验结果证明我们建立的 ELISA 法具有较好的特异性.血清抗-GBV-B 检测结果表明各型肝炎患者血清抗-GBV-B 阳性率为10.56%;其中非甲～非戊型肝炎患者血清抗体阳性率为8.57%;肝炎高危人群如献血员、血液透析者及静脉药瘾者血清抗-GBV-B 阳性率分别为2.90%,8.62%及13.44%.随机抽取抗-GBV-B 阳性和抗-GBV-B 阴性血清标本各32例进行RT-PCR 检测 GBV-B RNA,结果64例均为阴性.应用抗-GBV-B 多克隆抗体为试剂,对42例肝炎患者肝组织进行免疫组化研究,均未检测出 GBV-B 相关抗原.结论提示 GBV-B 可能不是人类肝炎病毒,对人体肝脏的致病性轻微,其抗体在不同人群中出现可能是一种短暂的感染,其意义有待进一步研究.

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 ( MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B( g B)基因 ,通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS- PAGE)分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验 ( ELISA)和间接免疫荧光试验( IFA) ,得到 1株 GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 ELISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株 CVI988、GA、RB1 B、MD1 1、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 ( CEF)均呈IFA阳性。 1∶ 1 0 0稀释时与 GA感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 ( dot- EL ISA)中呈阳性。

大中型猪场猪伪狂犬病抗体检测与分析

为了解大中型猪场猪伪狂犬病免疫抗体水平,采用ELISA方法对辽宁3个区域大中型猪场共7个场采集猪血清样品共270份进行猪伪狂犬病gE抗体和gB抗体检测。结果显示:猪伪狂犬病gE抗体和gB抗体的总阳性率分别为15.9%和85.9%。其中区域一、区域二、区域三猪伪狂犬病gE抗体阳性率分别为21.8%、0和23.8%,猪伪狂犬病g B抗体阳性率分别为85.5%、91.3%和81.3%。结果表明:大中型猪场的免疫措施得当,免疫效果明显,但还存在感染的猪只。区域一和区域三所采样的大中型场中均有不同程度的野毒感染,区域二的野毒感染率和免疫抗体水平均优于其它两个地区。

运用双重PCR和ELISA法对云南部分地区PRRSV和PRV的检测分析

为了解云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的流行情况,试验采集云南省不同地区具有呼吸道症状的猪血清样品174份,首先建立PRRSV-GP基因和PRV-gB基因的双重PCR检测方法,然后运用建立的双重PCR方法和ELISA抗体检测试剂盒对PRRSV-GP和PRV-gB的阳性率及抗体水平进行检测分析。结果表明:试验建立了最低检测限度分别为1.48 ng/μL和0.67 ng/μL的PRRSV-GP和PRV-gB的双重PCR检测方法;单一PCR和双重PCR检测的PRRSV-GP阳性率为45.4%(79/174),PRV-gB阳性率为75.86%(132/174),混合检出率为5.17%(9/179);ELISA检测试剂盒检测的gE阳性率为0(0/174),PRRSV和PRV-gB的阳性率结果与单一PCR、双重PCR检测结果一致。说明试验构建的双重PCR方法有良好的敏感性和特异性;云南省部分地区PRRSV抗体阳性率低且免疫效果较差,PRV抗体阳性率相对较高且免疫效果良好。

规模化猪场伪狂犬病净化方案应用效果的研究

猪伪狂犬病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,在我国一些大型规模化猪场普遍存在,直接或间接影响我国养猪业的健康发展,该病已被列入《国家中长期动物疫病防治规划》(2012-2015年)重点优先防制和净化的疫病。本研究是在应用猪伪狂犬病gE/gB-ELISA监测方法(GB/T 18641-2002)进行规模化猪场猪伪狂犬病抗体监测区分PRV野毒与疫苗毒感染的基础上,配合猪场从PRV病原学检测区分PRV野毒与疫苗毒的多重PCR(mPCR)方法和生物安全措施的建立,对贵州某规模化猪场伪狂犬病进行净化方案应用效果进行研究。先后开展了对安顺某规模化猪场血液进行了4次PRV-gB/gE ELISA抗体监测及PRV抗原检测,共监测样品为1 837份,检测结果表明,安顺某规模化猪场在开展伪狂犬病净化工作之后猪PRV-gB抗体水平均达到90%,PRV-gE抗体阳性率及PRV抗原阳性率均降为0,表明所开展的净化方案对规模化猪场猪伪狂犬病的净化工作有明显的效果,该研究可为规模化猪场伪狂犬病的净化提供参考。

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET32a-gE蛋白分子量约为41 kDa。分别以gB和gE重组蛋白作为包被抗原,建立了PRV抗体间接ELISA检测方法。该方法中重组蛋白仅与PRV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可用于PRV抗体的监测,鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪伪狂犬病净化工作。

闽北地区猪伪狂犬病抗体检测分析

为了解猪伪狂犬病在闽北地区的流行情况,整理并分析2015年度血清抗体检测数据。采用ELISA检测方法对闽北地区45个规模化猪场进行检测分析,通过检测样品血清中伪狂犬病g E抗体和g B抗体的水平进行结果判定。结果显示:送检的45个规模化猪场,伪狂犬病g E抗体阳性场达25个,猪场阳性率达55.6%;共检测1 304份血清,其中伪狂犬病g E抗体阳性213份、可疑24份、阴性1 067份,抗体阳性率达20.6%。从伪狂犬病g E抗体阴性猪场抽检猪伪狂犬g B抗体380份,g B抗体阳性258份,猪群伪狂犬病抗体保护率仅有67.9%。

三种猪伪狂犬病抗体监测方法的比较

本试验以伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-k61制备灭活疫苗,接种PRV抗体阴性猪,然后用g B ELISA抗体检测法、中和抗体指数法和中和抗体法进行效果监测。结果显示:三种方法都能检测到疫苗接种后发生了免疫应答,但以中和指数值和中和抗体值来表示猪群免疫效果更为准确,g B ELISA抗体阳性率不能作为群体免疫效果指标。

伪狂犬病毒gB基因的研究进展

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)主要感染猪,能够引起感染动物的死亡和流产,给世界养猪业带来了严重危害。随着分子生物学的发展,伪狂犬病毒的研究取得了显著进展。综述了PRV的主要保护性抗原基因g B的结构特点和功能研究进展以及其编码的糖蛋白g B在PRV疫苗研究和伪狂犬病防控研究中取得的进展。

3种猪伪狂犬病gB抗体ELISA检测试剂盒的比较

采用3种猪伪狂犬病gB抗体ELISA检测试剂盒检测121份血清样品,对检测结果进行Kappa一致性检验。结果显示:3种gB抗体检测试剂盒都具有很好的重复性,两两之间检测结果的符合率达80%以上,Kappa值>0.6,表明3种检测试剂盒具有较好的重复性和一致性。

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 kD;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV)的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明:1)对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2)该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3)在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。