基于gE蛋白的羊伪狂犬病病毒间接ELISA的建立与应用

为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为42 ku,以包涵体形式表达;Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白作为包被抗原的最佳工作浓度为1μg/mL,待检血清100倍稀释,以HRP标记的兔抗山羊IgG 10000倍稀释作为二抗;检测临床样本时判定阴阳性的临界值为0.284;灵敏性试验结果显示,羊PRV阳性血清稀释2048倍时检测结果仍为阳性;批内变异系数(2.45%~5.00%)与批间变异系数(2.55%~7.41%)均小于10%;采用建立的方法检测其他常见羊源病毒阳性血清结果均为阴性;对收集的376份临床羊血清进行检测,PRV阳性率为10.6%。建立的间接ELISA检测方法可用于羊源样本中伪狂犬病病毒抗体的检测,该方法的建立为羊场PRV抗体检测提供了技术支持。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速的猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒抗体检测方法,试验采用原核表达技术对PRV流行毒株的gE蛋白进行了原核表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA检测方法。结果表明:获得了以包涵体形式表达的重组gE蛋白,经Western blot鉴定表明重组gE蛋白具有良好的免疫学活性,以该蛋白作为包被抗原建立的检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法检测PRV疫苗免疫血清、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV、FMDV阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的最低检出效价为1∶10240,批内和批间重复性试验的变异系数分别为2.19%~3.33%和3.01%~4.40%,与国外商品化gE-ELISA试剂盒的符合率达98.72%,应用该ELISA检测河南省部分地区采集的1128份猪血清样品,PRV野毒抗体阳性率为8.07%。说明建立的PRV野毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为PRV野毒抗体的流行病学监测和净化提供了技术支持。

伪狂犬病病毒Fa株gE基因在大肠杆菌中的表达及gE-ELISA鉴别诊断方法的建立

试验以pPGE DNA为模板,用1对分别含有EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切位点的伪狂犬病病毒gE基因特异性引物,扩增出约1.7kb的含完整gE基因的DNA片段;目的片段经EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切后,插入原核表达载体pBV220得到重组表达质粒pBVgE,并转化大肠杆菌DH5α;对温敏诱导表达所获产物进行SDS-PAGE、Western-Blot和琼脂双扩散检测。结果表明,gE糖蛋白得到了高效表达,表达产物约占总蛋白的17%。为了鉴别伪狂犬病疫苗免疫猪和自然感染猪,用表达纯化的gE蛋白为抗原,建立了GE-ELISA方法。选定的反应条件包括GE抗原包被浓度为6.6mg/L,血清最适稀释度为1∶40。测试结果:与PRV、HCV、PRRSV、JEV、SA215阳性血清呈阴性反应,而与PRV标准阳性血清呈阳性反应。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于猪伪狂犬病的临床诊断,尤其疫苗免疫猪和自然感染猪的鉴别。

三种伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的比较

为比较3种品牌(A、B、C)伪狂犬病病毒(PRV)g E抗体ELISA检测试剂盒的临床使用效果,应用中和试验来标定伪狂犬病非免疫猪场的180份临床血清样品,同时用3种试剂盒进行检测,并对试剂盒的重复性、敏感性、特异性以及与中和试验结果的符合度等指标进行测定与分析。结果显示:3种试剂盒的批内稳定性均较好,变异系数均小于10%;批间重复性差异较大,变异系数最小者为8.09%,最大者高达21.31%;3种试剂盒的诊断特性良好,敏感性为95.56%~97.78%,特异性为94.44%~100%;各试剂盒检测结果与中和试验结果均完全相符(Kappa值为0.91~0.96)。比较结果表明,3种试剂盒均适用于临床样品的PRV g E抗体检测,其中稳定性及敏感性俱佳的试剂盒C更适用于PRV的持续监测、早期发现、引种检疫及净化效果评估,而特异性与准确性最高的试剂盒B更适用于贵重病畜的诊断淘汰。因此,生产实践中应根据诊断目的合理选择最适试剂盒。

猪伪狂犬病血清抗体gE-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪伪狂犬病病毒gE蛋白为抗原建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接gE-ELISA方法。最佳反应条件为,抗原包被浓度为1.7μg/mL,待检测血清1∶40稀释。与伪狂犬病阳性血清反应为阳性,与猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和猪伪狂犬病gE缺失疫苗接种的猪免疫血清及SPF猪阴性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数分别不超过5%和9%。用该方法与Ingezim ELISA试剂盒和HerdChek ELISA试剂盒同时对172份血清进行了平行检测,总符合率分别达93.6%和83.7%。试验结果表明:猪伪狂犬病血清抗体间接gE-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病野毒感染猪的血清抗体检测。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法并进行相应优化,研制出了猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,并与国内市场标杆产品进行比较,发现阳性符合率为88.03%,阴性符合率为91.47%,总体符合率达到89.84%。同时,该试剂盒批间、批内变异系数均小于10%,具有较好的重复性。该检测试剂盒的研制,可为猪场猪伪狂犬病毒野毒感染的检测提供技术支撑。

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%.

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白原核表达及间接ELISA检测方法研究

本研究以牛传染性鼻气管炎gE基因的原核表达产物为抗原建立检测IBRV抗体间接ELISA检测方法。通过DANStar比对分析牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白序列,通过亲和层析对重组表达产物进行纯化,经Western blot检测证明重组表达产物能被IBRV标准性鼻气管炎gE蛋白长度为500 bp的特异性肽序列,随后构建了pCold-TF-gE原核表达体系,并用Ni-IDA进行纯化。以纯化鉴定后的表达产物为抗原(1 μg/mL)包被酶标板制备多克隆抗体血清,并建立检测牛传染性鼻气管炎血清抗体间接gE-ELISA方法。结果显示:阳性OD_(450)值为0.369,组内组间重复性小于5%,敏感性强,与口蹄疫等阳性血清均无交叉反应且特异性达95%。利用建立的gE-ELISA方法,同时和IDEXX(IBR)抗体检测试剂盒对200份临床阳性血清进行检测比较,符合率均达到95%。该方法特异敏感高效,可用于牛传染性鼻气管炎血清抗体的检测。

PRV SD株gE基因主要抗原区域原核表达及间接ELISA方法的建立

参考猪伪狂犬病病毒(PRV)SD株g E基因序列,设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含g E主要抗原表位编码区的618 bp片段,将其用Bam HⅠ和Xho L I双酶切后,插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达、SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和纯化;利用表达的PRV SD g E蛋白进行g E-ELISA鉴别检测方法研究。结果发现:gE重组蛋白得到了高效表达,融合蛋白的分子量约为42ku;表达产物存在于上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,并且能被PRV抗体所识别。将纯化后的g E蛋白作为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪Ig G为二抗,建立检测PRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:确定的抗原最佳包被浓度为36μg/m L,最佳包被时间为37℃、1 h并4℃过夜,待检血清(1:50稀释)37℃作用1 h,二抗(1:3 000)37℃作用1 h。重复性试验、交叉试验证明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。用g E-ELISA和IDEXX g E-ELISA同时对采集的92份猪血清进行平行检测,发现该方法的特异性为85.71%,敏感性为90.63%,二者符合率为89.13%。该方法为我国猪伪狂犬病的鉴别监测提供了一种可供选择的技术手段。

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET32a-gE蛋白分子量约为41 kDa。分别以gB和gE重组蛋白作为包被抗原,建立了PRV抗体间接ELISA检测方法。该方法中重组蛋白仅与PRV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可用于PRV抗体的监测,鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪伪狂犬病净化工作。

两种猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒效果评价

目的:为了评估A、B两种猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒的检测效果,为猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒提供选择依据。方法:试验将12份待检血清样品进行检测并计算A、B试剂盒的符合率和阳性率;通过对3份留样血清样品进行梯度稀释、设置平行实验进行检测,评估两种试剂盒的重复性、灵敏度和稳定性。结果:用两种试剂盒检测,样品的阳性率均为33.3%,符合率为100%;通过稀释留样血清样品的检测和平行试验发现:用A试剂盒检测两份样品,检出显示阳性的最低稀释度分别为1∶64和1∶16;用B试剂盒检测2份样品,检出显阳性的最低稀释度分别为1∶32和1∶8。结论:两种试剂盒重复性好,均适用于临床样品的PRV gE抗体检测,但A试剂盒灵敏度高于B试剂盒,而B试剂盒稳定性更高且价格更低。说明生产实践中应对A、B试剂盒的重复性、灵敏度、稳定性和价格因素进行综合考量,合理选择性价比更高试剂盒。

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的建立

为了制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白gE的单克隆抗体并制备竞争ELISA猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒,以原核表达系统表达PRV FA株囊膜蛋白gE的主要抗原表位区段(aa52~aa238)的His标签,获得了融合蛋白gE-6×His;将gE-6×His纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾脏制备脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),进行细胞融合,以感染PRV的PK15细胞的蛋白为样本检测抗体,使用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞系,获得了2株稳定分泌抗PRV gE单克隆抗体的杂交瘤细胞系。结果显示:制备的抗体特异性好,效价为1∶5120;以单克隆抗体为检测抗体建立的竞争ELISA抗体检测方法灵敏、特异。

某规模化猪场猪伪狂犬gE和gB抗体的检测与分析

[目的]了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水平.[方法]采用ELISA法对2010～2013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1 217份进行猪伪狂犬野毒（gE）抗体和免疫（gB）抗体检测.[结果]种猪与育肥猪猪伪狂犬野毒总样品阳性率分别为13.5％和28.4％,其中60～ 100日龄的育肥猪总样品阳性率为5.2％,100 ～210日龄的总样品阳性率为42.1％;种猪伪狂犬免疫抗体总样品阳性率分别为92.2％,60 ～160日龄的育肥猪猪伪狂犬免疫抗体阳性率呈波动变化,血清样品总阳性率为50％.[结论]该猪场育肥猪群野毒感染率较种猪群高,且100日龄以后的育肥猪群野毒感染率较高,种猪群的免疫抗体水平高于育肥猪群,80～130日龄育肥猪免疫抗体水平较低.

伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原 ,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原 ,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中 ,得到的重组表达载体转化GS1 1 5酵母 ,通过G41 8抗性筛选得到一株多拷贝的重组酵母 ,经甲醇诱导表达了截短的gE蛋白 ,并分泌到胞外。Westernblotting分析显示表达的蛋白大小为3 3kD。ELISA结果表明表达蛋白具有良好的抗原性 ,重组酵母的诱导培养上清不需纯化可直接作为抗原检测gE的抗体 。

猪伪狂犬病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速检测猪伪狂犬病病毒(PRV)的血清学方法,本实验采用原核重组表达的g E蛋白作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测PRV血清抗体的间接ELISA方法。以该方法检测PRV阳性血清和其它猪病病原阳性血清,除了PRV阳性血清呈阳性外,对其它猪病病原阳性血清的检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别是5.95%和9.62%。此外,使用该方法对250份临床血清进行检测,与国内外4种商品化试剂盒的检测结果比较符合率最高为83.6%。表明该方法可以用于PRV的临床检测,为PRV流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。

2013～2016年广西部分规模猪场猪伪狂犬病gE抗体检测分析

为了解广西壮族自治区规模猪场猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒感染情况和流行态势,对2013年1月～2016年12月广西14个地级市290个规模猪场共送检的8676份血清样品,应用gE-ELISA进行PRV gE抗体血清学检测。结果显示,290个猪场中,142个猪场为PRV野毒感染阳性场,阳性率为48.97%;受检猪血清样品8676份中,PRV gE抗体检出阳性数为1957份,阳性率为22.56%; 2013～2016年,PRV gE抗体检出阳性率分别为4.68%、21.16%、24.00%和29.85%,PRV gE抗体检出阳性率呈逐年上升趋势。

某规模化猪场PRV gE抗体的检测与分析

利用gE-ELISA技术对闽南某规模化猪场共51份血清进行PRV gE抗体检测。检测结果表明,不同猪群PRV gE抗体阳性率存在差异,能繁母猪群PRV gE抗体阳性率较育肥猪高。并对猪场防控猪伪狂犬病提出建议和对策。

2019—2021年北京市种猪场猪伪狂犬病病毒感染情况调查

为了解北京市种猪场猪群伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA),对2019—2021年3个区采集的10850份血清样品进行PRV感染抗体(gE抗体)检测。结果显示:2019—2021年,北京市3个区种猪场群体表观阳性率分别为84.38%、77.78%、64.71%,群体真实阳性率分别为86.10%(95%CI:73.95%~98.24%)、79.37%(95%CI:60.39%~98.34%)、66.03%(95%CI:43.22%~88.83%),下降趋势不显著(P>0.05);个体表观阳性率分别为53.95%、41.52%、35.59%,个体真实阳性率分别为55.05%(95%CI:53.05%~57.05%)、42.37%(95%CI:40.90%~43.84%)、36.32%(95%CI:34.85%~37.79%),呈显著下降趋势(P<0.05)。育成猪、经产母猪和后备母猪个体阳性率逐年下降,而育肥猪个体阳性率逐年升高,由2019年的38.45%,提高到2021年的60.79%。结果表明,北京市种猪场PRV感染得到一定的控制,但感染情况依然严重,尤其是育肥猪,因此应继续加强免疫和监测及生物安全体系建设,逐步实现种猪场净化和根除PR的目标。

湖南省部分规模猪场伪狂犬病野毒血清流行病学系统监测与净化分析

自2011年1—11月,先后从湖南省19个规模猪场采集1 096份种猪血清、551份仔猪和肥育猪血清样本,利用gE-ELISA(酶联免疫吸附试验)方法对湖南省19个使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗的规模化猪场进行野毒血清抗体的监测与全面分析,结果共检出12份阳性样本,总样品阳性率为0.73%,4个猪场检测到伪狂犬病野毒抗体,猪场阳性率21.05%;显示伪狂犬病仍然在湖南省呈地方性流行,感染压力仍然偏高。种猪野毒总阳性率为0.64%,其中阳性场种猪的阳性率为6.19%,种猪带毒现象仍然普遍。在伪狂犬病阳性场的种猪群中,阳性样本主要集中在后备母猪及胎次较高的母猪群,表明近几年伪狂犬病控制在朝有利的方向发展,但种猪阳性率偏高仍是伪狂犬病控制与净化的关键。在所监测的19个猪场中,仔猪群的样品阳性率和伪狂犬病阳性场仔猪的野毒阳性率都低于对应的种猪群,但有个猪场仔猪伪狂犬病野毒阳性,种猪却没有,表明仔猪野毒感染不容忽视;在仔猪伪狂犬病阳性场中,野毒抗体集中在1～4周龄、17～24周龄。由于仔猪伪狂犬病野毒抗体既可能来自感染,也可能来自母源抗体,因此在进行伪狂犬病野毒血清流行病学调查时应分群、分阶段检测,了解检测样品的来源信息和免疫信息,以准确分析和把握流行动态。结果还表明,生长育成阶段后期有野毒感染,此阶段感染是伪狂犬病流行的重要特点,这与有些规模猪场只重视母猪免疫、忽视仔猪的免疫接种工作有关。目前,疾病呈多重、复杂的趋势,使用优质的gE基因缺失疫苗强化免疫是控制和净化伪狂犬病的重要手段,同时要加强环境消毒,细化生产管理,安全引种混群、注重后备猪的选择、加强定期监测工作,采取综合防控措施遏制湖南省伪狂犬病的流行。

闽西南地区部分规模化猪场猪伪狂犬野毒感染的血清流行病学调查

为了掌握闽西南地区规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和流行趋势,应用ELISA方法对2012-2014年闽西南地区的859个规模化猪场22324份血清进行PR野毒感染血清学调查。调查结果显示被调查的猪场血清样品总阳性率为21.8%,场阳性率为57.0%;母猪、公猪、哺乳小猪、保育猪、育肥猪及后备猪的血清样品总阳性率分别为22.0%、23.7%、16.7%、15.6%、19.2%和27.2%,不同阶段的猪群PRVgE抗体阳性率差异显著(P<0.01)。2012年-2014年猪场阳性率分别为46.7%、45.4%和57.0%,血清样品阳性率分别为20.5%、18.4%和25.4%;血清样品阳性率在30%以上的猪场比例逐年上升,分别为14.8%、19.9%和32.2%;不同地区猪场PR野毒感染情况不同。结果表明近年闽西南规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染压力依然很大,猪伪狂犬病的控制与净化形势严峻。