缺氧、复氧条件下低氧反应元件(HRE)对心肌细胞转染hVEGF_(165)基因表达的调控作用

目的:探讨缺氧、复氧条件下,低氧反应元件(HRE)作为氧条件基因表达控制开关,对心肌细胞转染rAAV-HRE9-hVEGF165基因表达的调控作用。方法:分离新生SD大鼠心肌细胞,采用无血清培养,将在HEK293T细胞进行包装后获得的腺相关病毒转染培养的心肌细胞。实验共分为8组:Ⅰ组(空白对照组):常氧培养24h(氧浓度21%);Ⅱ组(缺氧对照组):常氧培养16h,缺氧8h(氧浓度1%);Ⅲ组(转基因对照组):常氧培养24h;Ⅳ组(转基因缺氧1组):转基因后缺氧8h;Ⅴ组(复氧1组):常氧培养16h,缺氧8h、复氧4h;Ⅵ组(复氧2组):常氧培养16h,缺氧8h、复氧8h;Ⅶ组(复氧3组):常氧培养16h,缺氧8h、复氧12h;Ⅷ组(转基因缺氧2组):转基因后常氧培养16h,缺氧20h。ELISA法测定培养液VEGF蛋白含量;细胞免疫荧光染色及RT-PCR分别检测细胞内VEGF蛋白及VEGF165mRNA的表达。结果:95%的培养心肌细胞可见自律搏动,cTn-I染色阳性率为86%;病毒转染率约为87%。Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ组培养液中VEGF蛋白含量显著高于其它各组(P<0·01),细胞免疫荧光VEGF蛋白染色呈阳性;RT-PCR测定显示,Ⅳ、Ⅴ及Ⅷ组可见484bp目的条带。结论:rAAV-HRE9-hVEGF165可成功地转染原代培养心肌细胞,在缺氧环境下,受HRE的调控,VEGF165mRNA及VEGF165蛋白可有效表达,而在常氧状态下,目的基因的表达及蛋白合成即行中止。

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子(的hVEGF165)为靶基因,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记(的hVEGF165)重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。

hVEGF基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合物的成骨能力研究

目的观察人血管内皮生长因子(hVEGF_(165))基因的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合的相容性及该复合物移植在体内的成骨情况,为其能否修复牙周骨质缺损提供依据。方法在体外将hVEGF_(165)基因转染的SD大鼠BMSCs种植于胶原膜BME-10X复合膜上,使用激光共聚焦扫描显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及组织学方法进行观察,并将该复合物植入裸鼠皮下,于4、8周处死裸鼠取材制成组织切片,H-E染色后观察异位体内成骨和血管生成的情况。结果复合物培养24h后见目的细胞在胶原膜中贴附、伸展,各层BME-10X胶原膜上均有数量不等的细胞附着。转染细胞在胶原膜表面复层生长,并进入内部间隙中。复合物植入裸鼠皮下后,可见新生胶原纤维、类骨质样结构和新生血管的形成。结论hVEGF_(165)基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,细胞-胶原复合物在裸鼠体内具有异位成骨及促进新生血管形成能力。

腺病毒介导hVEGF编码基因转染骨髓基质干细胞的实验研究

目的应用携带hVEGF基因的重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),观察hVEGF的表达情况。方法体外培养大鼠骨髓基质干细胞,含hVEGF基因的重组腺病毒转染骨髓基质干细胞,转染后在荧光显微镜下观察并采用ELISA法检测hVEGF的表达水平。结果 rAd-hVEGF转染骨髓基质干细胞后,ELISA检测发现转染组上清液中hVEGF蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论 rAd-hVEGF转染大鼠骨髓基质干细胞能够表达并分泌hVEGF,为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供可行性研究。

裸基因PCHO/hVEGF-D大鼠肝内注射促血管形成效应的研究及意义

目的 检验裸基因PCHO/hVEGF D大鼠肝内注射后的表达及效果 ,验证该质粒应用于大鼠肝脏的可靠性。方法 10只雌性SD大鼠肝组织表面点注射PCHO/hVEGF D ,5 0 μg/点 ,共 3点。对照肝叶等量生理盐水注射。注射后第 8天 ,通过原位杂交法、免疫组化法分别检测肝组织hVEGF D的mRNA和hVEGF的蛋白表达 ;Ⅷ因子法计数两组之间的血管数量。结果 质粒组有大量hVEGF D的mRNA表达 ,而对照组未检测到 ;hVEGF的蛋白表达在质粒组显著高于对照组 ,P <0 .0 1;血管计数质粒组和对照组分别为 :10 .2± 2 .78和 7.1± 2 .0 2 (P <0 .0 5 )。结论 裸基因PCHO/hVEGF D大鼠肝内注射可以得到高效持续表达VEGF ,并能发挥其作用 ,促进新生血管的形成。