甘蓝型油菜种子中G3PDH基因特异性表达的ihpRNA载体构建

为验证甘蓝型油菜甘油-3-磷酸脱氢酶基因(G3PDH)的功能,采用PCR的方法克隆BnG3PDH557bp的干扰靶序列,将其正向片段插入到中间载体pHurricane的NotI酶切位点、反向重复序列插入到XhoI酶切位点,构建ihpRNA载体反向重复框,BamHI、EcoRI酶切下反向重复框后组装到由种子特异性表达的napin启动子驱动的pCAMBIAl390植物表达载体上。结果表明:PCR扩增产物、限制性内切酶酶切产物与预期片段长度相符。其中,1.7kb的片段包括正向干扰靶片段和部分AtFad2内含子序列,2.3kb大小的片段是干扰反向重复框。种子特异性表达的BnG3PDHihpRNA载体成功构建。

甘蓝型油菜种子特异性表达fad2基因的ihpRNA载体构建

旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和酶基因(fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM-T easy载体中。利用中间载体pHurrican构建fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式连接到该内含子的3’末端;然后将Nap in启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMB IA2300的pUC18多克隆位点,构建具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNFIRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。

甘蓝型油菜PEPC基因ihpRNA表达载体的构建与遗传转化研究

为提高油菜含油量,构建了基于油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的ihpRNA植物表达载体。分别从甘蓝型油菜基因组中克隆了种子储藏蛋白napin基因启动子(315 bp)、PEPC基因的外显子片段(246 bp)及PEPC基因的内含子(754 bp),包含了其剪切位点之前4 bp和之后18 bp片段。通过中间载体pBluescriptⅡSK(+)再构建到pBI121中,构成种子特异表达的内含子剪接的PEPC基因的RNA干扰载体p BI121.NP+IP-。利用农杆菌介导法对湘油15号进行遗传转化,获得卡那霉素抗性转化植株9株,PCR检测证实外源片段成功导入其中7株油菜基因组中。对T2种子中含油量检测发现比对照提高10%左右。

甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

为了通过转基因途径获得油菜种子中PEPC基因发生转录后基因沉默,通过PCR扩增分别分离得到了甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列(1138bp)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因保守序列(181bp),将它们分别克隆到pMD18-T载体中,利用中间载体pBS-NEI构建了PEPC基因的反向重复框。再将PEPC基因片段以正向的方式连接到一个可剪切的内含子5'末端,以反向的方式连接到该内含子的3'末端;然后将Napin启动子序列克隆到植物表达载体pCAMBIA1391的pUC18多克隆位点上,获得了种子特异表达的载体pCAMNapin;再将PEPase基因的反向重复序列克隆到pCAMNapin载体Napin启动子的3'末端,构建了具有种子特异性表达的PEPC基因的ihpRNA表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。通过限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。

大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。

紫花苜蓿LEA蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号为EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/LEAf2和LEAr1/LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,经过NotI酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体pART-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到16株阳性转基因植株,为MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。

Floral-dip转化法将PEPC基因ihpRNA干扰表达载体导入甘蓝型油菜

根据磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因控制油菜籽中蛋白质与脂肪酸合成的原理,构建了PEPC基因片段ihpRNA干扰表达载体,该载体包含了一个PEPC基因片段正反向序列的回文结构.表达RNA干扰的载体结构(ihpRNA),在大肠杆菌体内进行克隆的过程中易被大肠杆菌自身携带的某种酶剪切,剪切位点不确定,可能是一种随机性的剪切.通过反复实验,最终获得了一个与我们设计一致的PEPC基因片段正反向序列结构,RNA干扰表达载体构建获得成功.利用花序浸渍法(floral-dip)转基因将构建的PEPC基因ihpRNA干扰表达载体转移到甘蓝型油菜中,并通过抗性筛选、PCR特异扩增、PCR-Southern杂交和克隆测序,对获得的转基因植株进行了鉴定,转化率达到了0.69%,说明floral-dip方法有效地实现了ihpRNA干扰表达载体的遗传转化.

蒙古冰草MwLEA3基因ihpRNA表达载体的构建

采用RT-PCR方法从蒙古冰草中克隆出MwLEA3基因的特异性cDNA序列,并连入克隆载体pGM-T中。根据植物中ihpRNA原理,成功构建了35S启动子调控的具有MwLEA3基因反向重复结构的ihpRNA表达载体pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX),并通过冻融法转化将MwLEA3基因的ihpRNA表达框架成功导入根癌农杆菌LBA4404中。

番茄茄红素β-环化酶基因高效沉默载体构建

番茄茄红素是番茄果实中含量最多的一种类胡萝卜素,也是植物类胡萝卜素代谢过程中的一个重要中间产物。它的环化是在茄红素β-环化酶(Lyc-b)和茄红素ε-环化酶(Lyc-e)催化下完成的,其中茄红素β-环化酶在番茄茄红素转变为β-胡萝卜素的过程中起主要作用。我们利用RT-PCR方法从番茄叶片中克隆出Lyc-b基因,将PCR产物与pGEM-T载体连接后进行测序,扩增的DNA序列与发表的茄红素β-环化酶序列一致。以此为模板,克隆了400bp左右的目的片段,利用Gateway系统构建Lyc-b基因目的片段的pJawoh18-2b ihpRNA表达载体。经PCR与酶切鉴定的阳性克隆转化农杆菌LBA1100,利用农杆菌叶盘法转化番茄获得了抗性愈伤及再生苗,以检测ihpRNA沉默载体能否降低茄红素β-环化酶基因表达,并为进一步了解该基因在番茄类胡萝卜素代谢过程中的作用奠定基础。这些数据未在本文列出。

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡ b高效沉默表达载体的构建及转化表达

淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)是淀粉合成的限速酶。为了进一步研究SBEⅡb沉默对玉米生长及直链淀粉合成的影响,克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEⅡb基因片段,构建了SBEⅡb的发卡结构表达载体p TFU-SBEⅡb hairpin,用农杆菌介导法将其导入玉米HiⅡ幼胚中,经除草剂筛选获得了194株转化再生植株,其中4株结实,获得转基因种子35粒。T1代植株经PCR及试纸条检测获得3株阳性材料,半定量RT-PCR结果得出SBEⅡb的表达量降低,推断出基因表达水平降低对直链淀粉的合成具有正效应。

OsCRY2基因抑制表达对水稻主要农艺性状的影响

利用已公布的水稻OsCRY2基因序列设计引物,扩增部分基因片段,成功构建了ihpRNA植物表达载体pSC1301-347-OsCRY2,并通过农杆菌介导法将OsCRY2干扰片段导入水稻获得了转基因植株。根据转基因植株主要农艺性状的表现,分析了该基因的功能。结果表明,抑制OsCRY2基因表达会强烈延迟水稻开花与成熟;转基因植株穗与剑叶变短,结实率下降,粒增长,其他农艺性状未见明显变化。

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3′端400bpcDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA(intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。