DCLK1和ITGA5在非小细胞肺癌患者中的表达及其与临床病理特征及预后的关系研究

目的 检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清双皮质素样激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)和整合素α5(integrin alpha5,ITGA5)水平并讨论二者与临床病理特征及预后的关系。方法 选取2017年6月1日至2020年7月1日在我院收治的116例NSCLC患者(NSCLC组)作为研究对象,收集同期100例健康受试者作为对照组,采用酶联免疫吸附法检测NSCLC组和对照组受试者血清中DCLK1和ITGA5的水平;根据预后情况将患者分为生存组和死亡组,ROC曲线分析血清DCLK1、ITGA5的水平对NSCLC患者3年发生死亡的预测价值,多因素Cox回归分析影响NSCLC患者发生死亡的因素。结果 NSCLC组患者血清DCLK1、ITGA5的水平高于对照组(P<0.05);不同吸烟史、TNM分期、分化程度、肿瘤直径以及淋巴结转移的NSCLC患者血清DCLK1、ITGA5的水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);死亡组患者血清DCLK1、ITGA5的水平均高于生存组(P<0.05);血清DCLK1、ITGA5单独及联合预测患者发生死亡的AUC分别为0.895(95%CI=0.824~0.944)、0.828(95%CI=0.747~0.892)、0.926(95%CI=0.862~0.966);DCLK1、ITGA5及淋巴结转移是影响NSCLC患者发生死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论 NSCLC患者血清DCLK1、ITGA5的水平异常升高,二者的表达水平与NSCLC患者临床病理特征和不良预后有关。

体外培养人眼晶状体上皮细胞整合素α5的表达

目的 探讨体外培养的人眼晶状体上皮细胞整合素α5的表达。方法 采用免疫荧光细胞计数检测法 ,对 2 0例先天性白内障患者术中的环形撕裂前囊膜进行原代培养并传代 ,取 2～ 3代细胞进行检测整合素α5的表达。结果 体外培养人眼晶状体上皮细胞整合素α5的表达阳性率平均为 93 .3 0 % ,阴性率为 6.70 %。结论 体外培养人眼晶状体上皮细胞高表达整合素α5 ,其可能在后发性白内障的发生和发展过程中发挥作用。

缺氧对人胰腺癌细胞整合素α5、β1表达的影响

目的探讨缺氧环境对人胰腺癌细胞株PANC1诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor1α，HIF-1α）、整合素α5（integrina，INFα5）和整合素β1（integrinβ1，INTβ1）表达及侵袭力的影响。方法以5％氧条件下培养PANC1，采用RT-PCR和Western blot检测HIF-1α、INTα5、INTβ1的mRNA和蛋白表达；采用Matrigel胶观测人胰腺癌细胞黏附侵袭能力的变化。并加入HIF-1a抑制剂YC-1缺氧培养PANC1，观察上述各指标的变化。结果HIF-1α蛋白表达从常规培养时0．497±0．011逐渐上升到缺氧培养24h的1．455±0．133（P〈0．05），应用YC-1后蛋白表达下降到0．465±0．073（P〈0．05），而HIF-1α mRNA表达无明显变化；INTα5蛋白从常规培养时0．964±0．032逐渐下降到缺氧培养24h的0．465±0．073（P〈0．05），应用YC-1后蛋白表达又上升到0．883±0．013（P〈0．05），INTα5mRNA的表达从0．212±0．023下降到0．018±0．002（P〈0．05），应用YC-1后再上升到0．069±0．011（P〈0．05）；INTβ1的蛋白和mRNA表达于缺氧培养及YC-1处理后均无明显变化。细胞侵袭力从常规培养时69．9±30．5逐渐上升到缺氧培养24h的105．0±14．9（P〈0．05），应用YC-1后又下降到79．7±20．9（P〈0．05）。结论缺氧微环境下HIF-1α过表达可能通过下调INTα5来调控胰腺癌细胞间和细胞与基质间的黏附能力，有利于进一步侵袭转移。

沉默CTGF对肝星状细胞凋亡及胞外基质表达的影响

目的 观测沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC_T6)的生长与凋亡,以及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、CTGF、整合素α5(integrin alpha 5,Itgα5)和Ⅰ型胶原(collagenⅠ, ColⅠ)表达的影响。方法 将CTGF-shRNA病毒感染HSC_T6(实验组)。空病毒感染的HSC_T6(空病毒组)或未感染的HSC_T6(正常组)作对照。在显微镜下观测被感染HSC_T6的生长与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达变化;采用CCK-8(cell count kit-8)比色检测被感染HSC_T6的增殖情况;流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测被感染HSC_T6的凋亡情况。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学分别检测PCNA、CTGF、Itgα5和ColⅠ的表达变化。结果 在显微镜下观察到被感染的HSC_T6高表达GFP。CCK-8结果表明,与对照相比,沉默CTGF基因的HSC_T6生长显著受抑,72 h开始其差异具统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,沉默CTGF基因可诱导HSC_T6凋亡。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学结果证实,沉默CTGF基因可在mRNA及蛋白水平明显下调HSC_T6的PCNA、CTGF、Itgα5与ColⅠ的表达,与对照比较,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论 沉默CTGF基因可下调HSC_T6的PCNA、CTGF、Itgα5及ColⅠ的表达,抑制HSC_T6的生长,诱导HSC_T6凋亡,其机制可能和HSC_T6的CTGF/Itgα5信号通路受阻紧密相关。

ITGA5慢病毒shRNA表达载体及Bel-7404稳定细胞系的构建

目的构建整合素α5基因(ITGA5)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定沉默ITGA5表达的肝癌细胞系Bel-7404。方法设计3条ITGA5基因特异性shRNA靶序列和1条非特异性序列作为阴性对照(NC),分别克隆到GV493质粒载体中,转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行DNA测序鉴定,包装成重组慢病毒,并纯化、测定病毒滴度。将4组慢病毒载体分别感染人肝癌细胞Bel-7404,使用嘌呤霉素筛选后,在荧光显微镜下观察GFP的表达,q PCR和Western blot分别检测各组中ITGA5的基因和蛋白质表达水平。结果 ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,q PCR和Western blot检测结果显示3种慢病毒干扰组的ITGA5表达水平均低于NC组(P均<0.05)。NC组m RNA的表达量为(100±2.3)%,ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组m RNA相对表达量分别为(10.7±3.7)%、(16.7±1.5)%、(11.8±2.9)%,且其干扰效率均达到70%以上,可选择其中一个干扰靶点进行后续实验。结论成功构建ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体,感染肝癌Bel-7404细胞并成功筛选出稳定沉默细胞系,为进一步研究ITGA5在肝癌中的生物学功能和作用机制提供了实验基础。

鳖甲煎改良方下调CTGF/Itgα5对肝星状细胞T6周期变化、细胞凋亡及Col1a1表达的影响

目的探讨鳖甲煎改良方(novel turtle shell decoction,NTSD)对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSCT6)的周期、凋亡、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)/整合素α5(integrin alpha 5,Itgα5)通路及1型胶原(Collagen type 1,Col1a1)表达的影响。方法以NTSD(含生药量为0.71 g/mL)处理的HSCT6为实验(NTSD)组,鳖甲煎丸(turtle shell pills,TSP,与NTSD相同剂量)处理的HSCT6作为阳性对照(TSP)组,未处理的HSCT6为正常对照组。采用流式仪(FCM)检测各组HSCT6细胞的周期、凋亡变化。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学技术分别检测各组HSCT6细胞的CTGF、Itgα5及Col1a1的mRNA及其蛋白的表达。结果 FCM检测结果显示,NTSD可将HSCT6阻滞于S细胞周期,并诱导其凋亡。定量PCR、Western blotting及免疫荧光细胞化学技术检测结果显示,NTSD可在mRNA与蛋白水平显著下调HSCT6的CTGF、Itgα5及Col1a1的表达,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 NTSD可通过下调CTGF/Itgα5将HSCT6阻滞于S细胞周期,诱导其凋亡,并影响其Col1a1的表达,以抑制其生长。

卵巢上皮性癌组织中转移抑制基因ME491/CD_(63)与整合素α5蛋白和mRNA的表达及其意义

目的探讨转移抑制基因ME491/CD63、整合素(integrin)α5蛋白和mRNA在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其意义。方法应用RT-PCR技术和原位杂交方法检测正常卵巢组织(Ⅰ组,30份)、卵巢良性上皮性肿瘤组织(Ⅱ组,10份)、卵巢交界性上皮性肿瘤组织(Ⅲ组,6份)和卵巢癌组织(Ⅳ组,48份)中ME491/CD63及integrinα5蛋白和mRNA的表达,并分析其与患者各临床病理指标的关系。结果(1)ME491/CD63与integrinα5mRNA表达水平Ⅰ组均为1.7±0.3,Ⅱ组均为1.5±0.3,Ⅲ组均为1.1±0.5,Ⅳ组均为0.6±0.4。各组间分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。卵巢癌组织中,ME491/CD63和integrinα5mRNA表达水平,不同年龄、病理类型间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而不同病理分化程度、手术病理分期及有无淋巴结转移间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。(2)ME491/CD63和integrinα5蛋白表达阳性率Ⅰ组和Ⅱ组均为100%,Ⅲ组均为50%;Ⅳ组均为31%,其中手术病理分期为Ⅰ期者均为7/7,Ⅱ期均为6/9,Ⅲ～Ⅳ期均为6%。Ⅰ、Ⅱ组分别与Ⅲ、Ⅳ组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。卵巢癌组织中,ME491/CD63和integrinα5蛋白表达阳性率,不同年龄、病理类型间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而不同病理分化程度、手术病理分期及有无淋巴结转移间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ME491/CD63和integrinα5蛋白和mRNA在卵巢癌组织中呈低表达,其表达缺失与病理分化程度、手术病理分期及淋巴结转移有关。

整合素α5在子宫颈癌中的表达及其意义

目的研究整合素α5在子宫颈癌中的表达及其与患者临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学染色法检测青岛市市立医院2014年1月至2017年12月60例子宫颈癌石蜡包埋组织及20例因子宫良性病变行全子宫切除术的正常子宫颈石蜡包埋组织中整合素α5蛋白的表达水平。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测青岛市市立医院2018年1月至7月20例新鲜子宫颈癌组织及20例良性子宫病变的正常子宫颈组织中整合素α5 mRNA的表达水平。分析整合素α5的表达与子宫颈癌患者临床病理特征的关系。结果整合素α5蛋白在子宫颈癌及正常子宫颈组织中的阳性表达率分别为63.3%(38/60)、35.0%(7/20),差异有统计学意义(χ2=4.893,P<0.05)。整合素α5 mRNA在子宫颈癌中相对于正常子宫颈组织的表达量(2-△△Ct)为1.6±0.4(t=5.529,P<0.01)。整合素α5蛋白的阳性表达与子宫颈癌的淋巴结转移有关(Z=-2.636,P=0.008)。结论整合素α5在子宫颈癌组织中高表达,且与淋巴结转移有关,有望成为子宫颈癌治疗的新靶点。

红花口服液缓解神经病理性疼痛的分子机制

目的:考察红花口服液(HOL)缓解神经病理性疼痛(NP)的药效作用特点并探究其分子作用机制。方法:基于脊神经结扎(SNL)大鼠模型,将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,HOL低、中、高剂量组(0.5、1.0、2.0 mL·kg^(-1)·d^(-1))及阳性药普瑞巴林组(25 mg·kg^(-1)·d^(-1)),每组6只。在脊神经结扎手术恢复3 d后,连续灌胃给药14 d并采集样本。期间检测各组大鼠的机械痛阈值和冷痛阈值,考察HOL的镇痛作用特点。将假手术组、模型组、HOL高剂量组的海马组织样本进行转录组测序,获取不同组别之间的差异表达基因,并进行通路富集分析,进而,选择与NP密切相关的靶标进行验证,进一步通过分子对接寻找HOL关键活性成分与靶标分子的具体结合位点。此外,检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)的表达水平,评价HOL对NP大鼠的影响。结果:与假手术组比较,模型组大鼠的机械痛阈值及冷痛阈值均明显降低(P<0.05)。与模型组比较,HOL组可有效升高其机械痛阈值及冷痛阈值(P<0.05);转录组分析发现,模型组与假手术组比较共有376个差异表达基因,其中上调基因124个、下调基因252个,模型组与HOL组比较共有194个差异表达基因,其中上调基因33个、下调基因161个。其中,类胰岛素一号生长因子(IGF1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-14(MMP-14)、酪氨酸激酶受体2(ERBB2)和整合素A5(ITGA5)与NP密切相关。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠海马中上述各分子的mRNA表达量均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,HOL组可有效降低其mRNA表达量(P<0.01)。分子对接结果显示,红花主要活性成分羟基红花黄色素A、山奈酚和槲皮素与上述靶标分子IGF1、MMP-2、MMP-14、ERBB2、ITGA5的氨基酸残基形成稳定的氢键作用力。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠血清中TNF-α/IL-10表达失衡(P<0.01),与模型组比较,HOL组可显著减少促炎细胞因子TNF-α的含量(P<0.01),增加抗炎细胞因子IL-10的含量(P<0.05)。结论:HOL对SNL大鼠具有镇痛作用,其机制与抑制神经炎症密切相关。