蛋白激酶全抑制分析揭示KG-1细胞增殖的分子机制

目的:通过分析KG-1细胞对各种蛋白激酶抑制剂的反应,探讨其增殖的分子机制。方法:采用CCK-8法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot检测各种蛋白激酶抑制剂对KG-1细胞增殖、相关基因mRNA表达水平以及FGFR1下游信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:NVP-BGJ398和PD173074有效抑制KG-1细胞的增殖,表明FGFR及其下游信号通路在KG-1细胞增殖过程中具有关键作用。使用FGFR抑制剂处理后,p-FGFR1和p-STAT5水平显著下降(P<0.001),p-Akt水平稍有下降(P<0.05),并未影响p-ERK水平(P>0.05)。结论:FGFR1OP2-FGFR1主要作用于下游STAT5信号通路,以促进细胞增殖。蛋白激酶全抑制分析是一种可靠而直接的方法,可用于确定癌细胞增殖的分子机制。

三氧化二砷联合普纳替尼对白血病细胞KG-1的抑制效应

目的:探讨小分子酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对人急性髓系白血病细胞KG-1的作用及可能机制。方法:CCK-8法检测普纳替尼及ATO对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术AnnexinⅤ/PI双重染色法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白、成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)蛋白及信号通路分子磷酸化水平的表达变化。结果:(1)ATO及普纳替尼对KG-1细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,两药联合较单药作用具有更高的增殖抑制率、更少的集落形成及更多的细胞凋亡,差异均有统计学意义。(2)与DMSO组相比,ATO或普纳替尼均能显著下调Bcl-2表达,上调Bax及Caspase-3表达(P均<0.05);与单药作用相比,联合用药促进Bax及Caspase-3表达的作用更强(P均<0.01)。(3)普纳替尼显著抑制FGFR1基因及蛋白的表达(P均<0.01),ATO的加入并未使FGFR1表达进一步下降。信号通路研究显示,ATO可以显著抑制m-TOR和MAPK、STAT5的磷酸化(P均<0.001),但对PI3K/AKT、STAT3的磷酸化无明显影响。普纳替尼可以显著抑制FGFR1蛋白表达及STAT3、STAT5的磷酸化(P均<0.001),但对PI3K/AKT及MAPK的磷酸化无明显影响。两药联合后,STAT3的磷酸化水平较ATO或普纳替尼单药组进一步下调(P均<0.01)。结论:普纳替尼及ATO可能通过不同机制抑制KG-1细胞增殖及集落形成并诱导细胞凋亡;两药联合可进一步增强对KG-1细胞株的抑制效应。

大黄素诱导白血病KG-1a细胞凋亡及对Bcl-2/Bax mRNA表达的影响

目的本研究观察大黄素(emodin)对人急性髓系白血病KG-1a细胞的增殖及凋亡影响,探讨Bcl-2/Bax基因在其中的作用。方法采用四唑蓝比色试验(MTT)检测大黄素对KG-1a细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化与凋亡情况;RT-PCR法检测大黄素作用后细胞Bcl-2/Bax mRNA表达的变化。结果大黄素能抑制KG-1a细胞的增殖,作用48 h的半数抑制浓度(IC50)约为171.8μmol/L流式细胞仪分析出现典型的亚二倍体峰(凋亡峰),将细胞阻滞于G0/G1期,大黄素作用后KG-1a细胞Bcl-2基因表达下调,而Bax基因表达上调,并呈量效关系。结论大黄素可诱导KG-1a细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2,上调Bax基因表达水平有关。

白藜芦醇增强TRAIL对人髓系白血病KG-1a细胞的细胞毒作用

目的：观察白藜芦醇作用前后TRAIL对人髓系白血病KG-1a细胞的细胞毒作用的变化。方法：流式细胞仪检测KG-1a细胞表面CD34和CD38的表达,二甲氧唑黄（XTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测白藜芦醇作用前后TRAIL对KG-1a细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡变化。流式细胞仪检测白藜芦醇作用前后KG-1a细胞表面TRAIL死亡受体表达变化。结果：人髓系白血病KG-1a细胞CD34＋CD38-占（58.67±2.87）%,101 000 ng/ml的TRAIL对KG-1a细胞增殖无明显影响,但对白藜芦醇作用后的KG-1a细胞的增殖有明显抑制作用,白藜芦醇能促进TRAIL诱导KG-1a细胞凋亡,并能上调KG-1a细胞表面TRAIL死亡受体DR5的表达。结论：白藜芦醇能增强TRAIL对人髓系白血病KG-1a细胞的细胞毒作用,其机制可能与白藜芦醇上调KG-1a细胞表面TRAIL死亡受体DR5的表达有关。

大黄素联合AZT对白血病KG-1a细胞的增殖及BCL-2、NF-κB、TGF-β表达的影响

目的:探讨中药大黄素(Emodin)和端粒酶抑制剂AZT(3'-azido-3'-deoxythymidine)联合应用对浓集白血病干细胞(concentrated leukemia stem cells,CLSC)的急性髓系白血病KG-1a细胞增殖及BCL-2、NF-κB、TGF-β表达的影响。方法:应用5-FU富集白血病KG-1a细胞中肿瘤样干细胞亚群并采用流式细胞术检测富集后CD34+CD38-亚群细胞;采用MTT法检测大黄素和AZT单用及联合应用对CLSC的生长增殖的影响;采用流式细胞术检测药物诱导CLSC的凋亡情况;采用RT-PCR及Western blot法分别检测NF-κB、BCL-2、TGF-βmRNA和蛋白表达变化。结果:大黄素和AZT联合后,细胞生长抑制明显大于大黄素和AZT单药组(P<0.01),具有一定的时间和浓度依赖性;细胞凋亡比例均较各单药组增多,差异具有统计学意义(P<0.01);NF-κB、BCL-2、TGF-βmRNA及蛋白表达在联合组比在各单药组表达量下降。结论:大黄素联合AZT具有协同抑制CLSC增殖并诱导其凋亡的作用,其机制可能与抑制BCL-2活化及降低NF-κB、TGF-β表达有关。

AZT对白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响

本研究探索端粒酶抑制剂3'-叠氮-2',3'-脱氧胸腺核苷(AZT)对人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响。用MTT法检测不同浓度AZT分别作用24、48、72 h时KG-1a细胞增殖水平;流式细胞术检测AZT对KG-1a细胞周期及细胞凋亡的影响;TRAP-PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性;RT-PCR法检测细胞端粒逆转录酶(hTERT)mRNA的表达。结果表明,AZT能抑制KG-1a细胞增殖,抑制作用具有时间和浓度依赖性;随AZT浓度的增加,处于S期的细胞数目减少,G2/M期细胞数目增加,且出现凋亡峰;AZT作用后实验组细胞的端粒酶活性降低,hTERT-mRNA表达下降,下调程度与AZT浓度呈正相关。结论:AZT在体外能明显抑制KG-1a细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制与降低端粒酶活性、下调hTERT mRNA表达有关。

热疗在阿霉素对KG-1a白血病细胞杀伤作用中的增敏作用

目的观察热疗在阿霉素对人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞杀伤作用中的増敏作用。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法确定阿霉素的工作浓度,以该浓度进行化学治疗和热疗联合化学治疗,选择温度40、42℃,体外作用于KG-1a细胞。作用前及作用48 h后,采用台盼蓝拒染法检测肿瘤细胞的存活率;MTT法检测对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率的变化。结果各处理组的存活率明显要低于对照组(P<0.01),40、42℃热疗联合化学治疗组的细胞存活率明显低于单纯的热疗组(P<0.01)和化学治疗组(P<0.01)。40、42℃热疗联合化学治疗组的细胞抑制率明显高于化学治疗组(P<0.01)和单纯的热疗组(P<0.01)。各处理组的细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01),40、42℃热疗联合化学治疗组细胞凋亡率明显高于化学治疗组(P<0.01)和单纯的热疗组(P<0.01)。结论热疗可以增加阿霉素对KG-1a细胞的杀伤作用,提高肿瘤细胞的凋亡率。

和厚朴酚增强NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤作用及机制研究

目的:观察和厚朴酚是否增强NK-92细胞对人急性髓细胞白血病KG-1a细胞的杀伤作用,并探讨其机制。方法:CCK8法检测和厚朴酚对KG-1a细胞的毒性作用,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤作用,流式细胞术检测和厚朴酚对KG-1a细胞凋亡的影响以及KG-1a细胞表面自然杀伤细胞2族成员D(natural killer group 2,member D,NKG2D)配体ULBP1、ULBP2和ULBP3的表达。结果:CCK8实验结果显示,随着和厚朴酚浓度的增高,KG-1a细胞的活力逐渐降低,但24 h后KG-1a细胞活力仍大于40%。LDH实验表明,10μmol/L的和厚朴酚处理KG-1a细胞24 h后,NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤率比用药前显著提高(P<0.01)。流式细胞术结果证实,和厚朴酚处理24 h后,在效靶比为5∶1时,NK-92细胞诱导KG-1a细胞的凋亡率显著高于未处理组(P<0.01)。同时,KG-1a细胞表面NKG2D配体(ULBP1、ULBP2和ULBP3)的表达显著高于未处理组(P<0.05)。结论:和厚朴酚可以通过上调KG-1a细胞表面NKG2D配体的表达增强NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤作用。

GM-CSF对受辐射KG-1细胞的增值及细胞周期的影响

以临床上常用的细胞因子GM-CSF刺激受辐射的人髓性白血病细胞株KG－1，观察细胞的增殖情况及周期变化。结果显示；GM－CSF刺激受辐射KG－1细胞的增殖；并且能促进细胞跳出GO／G1阻滞，对S期似有促进作用及增加G2／M期。对未受照射的KG－1细胞，GM－CSF刺激效应不如受照射细胞。

洛伐他汀对HL-60、KG-1、K562白血病细胞体外作用的研究

目的:观察胆固醇合成抑制剂洛伐他汀(lovastatin,LOV)对HL60、KG1、K562白血病细胞增殖、凋亡的影响,并进一步探讨其作用机制。方法:首先利用MTT法、台盼蓝拒染法观察LOV对HL60、KG1、K562细胞增殖及活力的影响。再通过细胞形态观察,DNA凝胶电泳,流式细胞术分析,RTPCR半定量测定bcl2mRNA水平等技术,系统观察LOV对HL60、KG1、K562体外诱导凋亡的情况。结果:①LOV抑制HL60、KG1、K562细胞增殖,IC50分别为17.16、51.65、58.95μmol/L;②LOV诱导HL60、KG1、K562细胞凋亡,影响细胞周期进程,细胞阻滞于G1/S期;LOV在诱导HL60细胞凋亡过程中随作用时间延长,bcl2表达水平逐渐下降。结论:LOV抑制HL60、KG1、K562细胞增殖并诱导凋亡,阻滞细胞周期进程于G1/S期;bcl2参与了LOV诱导凋亡的基因调控。

白藜芦醇诱导KG-1细胞凋亡作用与bcl-2/bax表达相关性研究

本研究观察白藜芦醇(RES)体外诱导KG-1细胞凋亡的作用,探讨白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的可能作用机制。以不同浓度的白藜芦醇作用于KG-1细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡与周期分布;半定量RT-PCR、流式细胞技术检测细胞bcl-2、bax表达水平。结果表明:白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(p<0.05),与对照组比较,白藜芦醇作用后KG-1细胞发生S期阻滞(p<0.01),细胞凋亡增高(p<0.01),bcl-2表达下调(p<0.05),而bax表达明显上调(p<0.01)。结论:白藜芦醇可诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2、上调bax表达水平有关。

大黄素和叠氮胸苷对Egr-1 siRNA转染的KG-1a细胞的增殖和凋亡的影响

目的:本研究旨在观察Egr-1基因KG-1a细胞转染后,大黄素联合AZT对KG-1a细胞增殖的影响及其作用机理。方法:采用电转法瞬时转染Egr-1 siRNA,细胞分为空白对照、非特异对照(转染非特异序列)和目的 siRNA(转染Egr-1 siRNA)3组。流式细胞术测定转染效率,MTT法检测各组细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测Egr-1基因的表达水平。各组细胞经大黄素10μmol/L或/和AZT 3200、1600μmol/L作用后,应用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:电转染Egr-1 siRNA转染效率可达59.21%以上,目的 siRNA组与空白对照和非特异性对照组相比,细胞增殖明显增加,Egr-1 mRNA的表达水平显著下降(P<0.001);大黄素和AZT联合对空白对照和非特异性对照组细胞的增殖抑制均呈现协同作用,联合作用指数(CI)均小于1,而对目的siRNA组细胞的CI大于1,增殖抑制作用与单用AZT相似(P>0.05)。目的 siRNA组细胞凋亡率较空白对照降低(P<0.001)。结论:大黄素联合AZT协同抑制KG-1a细胞增殖和促进凋亡的作用与Egr-1基因有关。

人白血病细胞系KG-1a中肿瘤干细胞样亚群细胞的初步研究

探讨人白血病细胞系KG-1a中是否存在具有肿瘤干细胞样生物学特性的亚群细胞。瑞氏染色和吖啶橙染色分别观察白血病细胞系KG-1a细胞形态和RNA含量;流式细胞术检测细胞周期分布;免疫组化和流式细胞术检测KG-1a细胞CD34的表达;流式细胞术检测CD34+CD38–亚群细胞;烟酸己可碱Hoechst33342染色后用荧光显微镜观察KG-1a细胞中侧群(side population,SP)样细胞所占比例。结果显示,白血病细胞系KG-1a细胞核仁易见,形态原始;部分细胞RNA含量低,细胞处于G0/G1期的比例占15.5%。绝大多数细胞的胞浆和胞膜皆表达CD34抗原,KG-1a中CD34+细胞占96.3%,CD34+CD38–亚群细胞占7.02%;SP样细胞大致比例为7.60%。本研究表明,人白血病细胞系KG-1a中存在具有肿瘤干细胞样生物学特性的亚群细胞。

沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病KG-1细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病细胞株KG-1增殖和凋亡的影响。将SUV39H1 siRNA经LipofectamineTM2000转染至KG-1细胞,应用MTS法检测细胞增殖率,观察SUV39H1 siRNA对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞凋亡;Western blot检测SUV39H1 siRNA作用后P15和凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达。结果表明,沉默SUV39H1基因可抑制细胞增殖,SUV39H1 siRNA浓度为30、60、120、240 nmol/L作用48 h后,KG-1细胞的增殖率分别为(76.43±1.98)%、(51.31±1.84)%、(37.31±1.61)%、(18.94±3.22)%,差异具有统计学显著意义(P<0.05);SUV39H1 siRNA可上调P15基因的表达;SUV39H1 siRNA可诱导细胞凋亡,30、60、120 nmol/L SUV39H1 siRNA作用48 h后,KG-1细胞凋亡率分别为(40.2±5.1)%、(56.8±4.8)%、(71.6±5.6)%,差异有统计学显著意义(P<0.05);抗凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达减少。结论:SUV39H1 siRNA能抑制KG-1细胞的增殖并诱导其凋亡,有望成为白血病治疗的一个新的靶点。

5-FU富集人白血病细胞系KG-1a中肿瘤干细胞样亚群细胞

探讨利用细胞周期特异性药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)从人白血病细胞系KG-1a中富集肿瘤干细胞样亚群细胞。体外药物敏感试验确定5-FU的最佳作用浓度和作用时间;KG-1a细胞经5-FU药物处理后,流式细胞术检测存活细胞群中CD34+CD38-亚群细胞比例;吖啶橙染色观察细胞内的核酸组成;RT-PCR半定量检测细胞内三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily Gmember2,ABCG2)mRNA的表达;半固体培养观察细胞的集落形成能力。结果显示,50μg/ml5-FU作用KG-1a细胞4天后,CD34+CD38-亚群细胞比例提高10倍以上;吖啶橙染色可见大部分细胞核酸以发出绿色荧光的DNA为主,RNA含量低;此类细胞高表达ABCG2 mRNA水平;而药物处理后细胞集落形成数量较未处理细胞明显减少。研究结果表明,利用5-FU能够杀死增殖期细胞的性质,成功建立体外药物筛选富集人白血病细胞系KG-1a中肿瘤干细胞样亚群细胞的方法。

信号通路抑制剂XL765对人白血病KG-1细胞株的抑制效应研究

目的:探讨PI3K/mTOR信号通路抑制剂XL765(SAR245409, Voxtalisib)对人急性髓系白血病细胞株KG-1细胞的抑制效应及可能的作用机制。方法:应用CCK-8法检测XL765对KG-1细胞增殖的影响;平板集落形成实验检测XL765对KG-1细胞集落形成的抑制情况;Annexin V/PI双染色流式细胞术检测XL765对细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的表达;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达水平及信号通路分子磷酸化水平的变化。结果:XL765能有效抑制KG-1细胞的增殖,抑制率呈剂量依赖性增加;与DMSO处理组相比,加入XL765后,KG-1细胞的集落形成能力显著下降(P=0.0002);XL765能有效诱导细胞凋亡(P<0.001);XL765作用KG-1细胞48 h后,细胞的凋亡相关基因BCL-2表达下调,BAX及Caspase3表达上调,其差异均有统计学意义(P<0.05);与DMSO组对比,实验组BAX及Caspase3活化蛋白表达上调,同时BCL-2蛋白表达下调,信号蛋白PI3K、AKT及S6K磷酸化表达下调,其差异均有统计学意义(P值均<0.005)。结论:XL765能有效抑制KG-1细胞增殖及集落形成,并诱导细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡蛋白BCL2、BAX及Caspase3水平及抑制PI3K、AKT及S6K磷酸化水平相关。

TGF-β_1对白血病KG-1细胞株Gli1表达的影响

目的证明在白血病KG-1细胞株中存在TGF-β信号通路对Gli的调控作用。方法 (1)用0.1、1、10ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞,时间分别为6、12、24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli1的表达。(2)5ng/mL TGF-β1、5ng/mL TGF-β1联合5μmol SIS3分别作用于KG-1细胞24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli1的表达。结果 (1)1～10ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞6、12、24h,从12h起并至少持续至24h,其Gli1的mRNA表达较对照组明显减少;(2)5ng/mL TGF-β1、5ng/mL TGF-β1联合5μmol SIS3分别作用于KG-1细胞24h,其Gli1的mRNA表达与对照组比较:5ng/mL TGF-β1组较对照组降低,而5ng/mL TGF-β1联合5μmol SIS3组较对照组明显增高。结论应用TGF-β1可以降低KG-1细胞Gli1的表达,TGF-β1降低KG-1细胞细胞Gli1的表达是通过TGF-β/Smad3途径介导的,可被SIS3所抑制,不依赖于Ptch/Smo途径。

白藜芦醇诱导KG-1细胞凋亡作用机制的初步研究

通过观察白藜芦醇诱导人急性白血病细胞株KG-1凋亡的作用,检测bcl-2、caspase-3的表达,探讨白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的作用机制。采用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;瑞-吉染色、透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡与周期分布;半定量RT-PCR检测bcl-2 mRNA、caspase-3 mRNA表达水平。结果显示白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.01),与对照组相比,实验组使细胞发生S期阻滞(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.01),使bcl-2的表达下调,上调caspase-3的表达(P<0.05)。结论:白藜芦醇能诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2、上调caspase-3表达水平有关。

白藜芦醇诱导白血病KG-1细胞凋亡及对其细胞周期的影响

目的:探讨白藜芦醇诱导人白血病细胞株KG-1细胞凋亡的作用。方法:以不同浓度的白藜芦醇作用KG-1细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FMC)测定细胞凋亡率和细胞周期分布。结果:白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.05),与对照组比较,白藜芦醇作用后,KG-1细胞发生S期阻滞(P<0.01),且细胞凋亡率增高(P<0.01)。结论:白藜芦醇能明显抑制KG-1细胞增殖,使细胞周期阻滞在S期,并能进一步诱导其凋亡。

雷公藤内酯醇联合高三尖杉酯碱对KG-1α细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨低浓度雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)联合高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)对KG-1α细胞增殖与凋亡的影响及其可能机制。方法:应用CCK-8法检测不同浓度TPL和HHT单用及联用对KG-1α细胞增殖的影响,并计算其药物联合作用指数(combined index,CI);甲基纤维素集落形成实验检测细胞集落形成能力;流式细胞术检测细胞表面分子、细胞凋亡率及细胞周期变化;Western blot检测Akt信号通路相关蛋白在TPL及HHT作用前后的表达情况。结果:KG-1α细胞高表达CD34CD123而CD38缺失;TPL及HHT单用对KG-1α细胞增殖抑制并具剂量依赖性(r=0.952,r=0.992);低浓度联合用药与单药对比,前者细胞增殖、集落形成率更低,而细胞凋亡率增高;CI值亦提示低浓度TPL联合HHT呈高度协同作用。低浓度TPL联合HHT作用KG-1α细胞后,P-Akt^(Ser473)、P-Akt^(Thr308)、BCL-2、PARP及Survivin蛋白表达降低而PARP裂解增加。结论:低浓度TPL联合HHT可通过PI3K/Akt信号通路及下游蛋白协同抑制KG-1α细胞增殖,并诱导其凋亡。